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질문 Corynebacterium glutamicum의 Deletion 실험 (SacB-Homologous recombination 이용)
알미공(대학원생)  |  2019.08.20 09:47

안녕하세요.

제목 그대로 Corynebacterium glutamicum의 Deletion 실험 (SacB-Homologous recombination 이용)을 하고 있는 대학원생입니다.

논문에 보고 되어있는 SacB-Homologous recombination (pK18mobsacB벡터이용)를 이용하여 Deletion을 진행하고 있는데요.

실험 중 2번째 Sucrose counter selection에서 막혀 질문 드립니다 ㅠ

 

자세히 말씀드리면 우선 Deletion하고자 하는 유전자에 pK18mobsacB를 포함한 2개의 fragment들 genome 상에 삽입 완료하여 1st mutant 구축하였고요. 

2nd homologous recombination을 위해 1st mutant를 LB broth에서 키운 후, Sucrose 배지에 spreading 하였습니다. 

이후, Counter selection을 위해, LB(+10% Sucrose)아가배지와 LB(항생제Kanamycin)아가배지에 Picking하였습니다. 

1000개 이상의 Selection을 진행하였지만, 모든 균주들이 항생제와 Sucrose배지 모두에서 콜로니가 나타났습니다. 이론상으로는 Sucrose에서만 떠야하는데 말이죠.

 

왜 이런지, 선배 연구자분들 경험 있으시면 조언 부탁드릴게요 ㅠㅠ 1000개 중에 1개도 안나와서 무언가 문제가 있는 것 같습니다.

#Corynebacterium
 
#deletion
 
#sacB
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
알goodtwo  |  2019.08.20   
안녕하세요. vector의 sacB 유전자가 제대로 working하지 않는 것 같습니다. mobsacB plasmid가 들어가 있는 cloning 균주의 colony(km 저항성)를 분리한 뒤, 10% sucrose+km agar 배지에 replica 하여 screening 이 제대로 되는 지 check 해 보시고, sacB 유전자 서열을 promoter 부위 포함하여 sequencing 하신 뒤에, 문제가 있으면 mobsacB vector를 새로운 cell stock에서 꺼내서 사용하시는 게 좋을 듯 합니다.
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