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 전체 > Cell Biology > Cell Culture
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질문 RAW cell의 배양 배지와 Activation에 대해 질문드립니다!!
알apple693(대학생)  |  08.18 17:17

동아대학교에서 RAW cell에 대해 공부 중인 학부생입니다.

RAW cell에 대해 몇 가지 궁금증이 생겨 질문을 올립니다.

 

1. 현재 배지를 RPMI로 키우고 있습니다. 하지만 많은 논문을 참고해보니 DMEM   으로 배양하는 경우가 더 많았습니다.  DMEM으로 배양할 시 부착능력 혹은 LPS에 대한 Activation이 더 잘 증가하는 건가요??

2. NO assay를 하기위해 LPS(1ug/ml)의 농도로 처리하여 24h 후에 griess시약을 이용하여 실험을 진행하였으나 비처리군에 비하여 높은 NO 증가값을 보이지 않았으며 Activation조차 잘 되지 않았습니다. 이런 경우에는 LPS의 농도를 증가시켜 assay해보는 것이 좋은 방안인가요???

3. 제가 COX-2 Western blot에 대한 논문들을 참고하여 LPS(1ug, 5ug/ml) 처리군과 LPS 비처리군을 실험한 결과 COX-2의 발현량이 LPS 처리농도가 증가할수록 감소되는 경향을 띄었습니다. 제 생각으로는 저의 테크닉 부족으로 인한 결과라고 생각되오나 혹시 원인이 있을지 궁금합니다!

 

+LPS는 sigma사의 LPS from E.coli 0111:B4 제품을 PBS에 1mg/ml의 스톡상태로 녹여 사용했습니다.

#RAW cell
 
#LPS
 
#Activation
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

1. 일단 저도 길게 키워 보지는 않았습니다만. 가장 기본적인 배지가 DMEM인게 크지 않을까 싶습니다. DMEM에서도 잘자라니까요

rawcell 은 plate바닥면에 부착하지 않은 cell입니다. 그러니 부착이 되면 상태가 안좋은거라고 알고있습니다. LPS에 대한 내성은 RPMI로 키워보지 않아서 비교가 힘드네요 

 

2. NO측정하셨을 때 컨트롤이 NO가 어느정도 나타났나요? 저로 실험 초기 단계이지만 컨트롤자체가 activation이 되어서 LPS를 처리 한다 해도 큰 차이가 없었습니다. 컨트롤이 0에 가까운 수치일때 NO발현이 나타났고 96well에 seed 하는 cell농도가 낮아도 값이 안나오기도 합니다.

 

3.이건 아직 저도 준비중인 실험이라 답변이 힘들긴 하지만 당연하게 나와야 할 결과가..안나오기도..합니다.... 요즘 많이 느껴요... cell컨트롤 문제도 있을것이지만 앞에서 activation이 잘 되지 않았다고 했으니 그 문제도 있겠네요

뒷다리시은  |  08.18 23:24  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. RPMI, DMEM 둘 다 상관없습니다. 저도 RPMI로 주로 실험했습니다.

2. griess assay 하실 때, LPS를 처리하지 않은 Normal 군에서 NO 농도가 0~5uM 정도 나오는 세포 상태에서 실험을 진행하셔야 합니다. 가장 최선은 Normal군에서 NO농도가 거의 안나오는 상태입니다. griess 시약을 배지와 섞었을 때, 노랗고 투명한 상태입니다. 만일, 색이 조금이라도 핑크색으로 변하면 그것은 세포 상태가 좋지 않음을 뜻합니다.

통상 논문에서는 100ng/mL~1ug/mL 정도로 LPS를 처리하고,

이 때 나오는 NO 농도는 10~40uM 정도 나옵니다.

질문자께서 비처리군에 비해서 LPS 처리시 NO 증가가 거의 없다고 하신걸 보면, 네 가지 가능성이 있는데,

하나는 이미 세포가 activation되어서 LPS에 자극을 덜 받는게 하나고, 다른 하나는 세포 상태가 안좋아서 LPS 자극이 안되는 가능성이 있겠습니다. 이럴때는 stock을 새로 풀어서 진행하시면 되겠습니다.

나머지 하나는, 적정 세포수, 적정 농도에서 실험을 수행하지 않으셨을 수도 있습니다. 논문에서는 대체로 96well, 5x10^5 ~ 1x10^6 cell 에서 200uL media에 culture한 soup을 이용하여 griess assay를 수행합니다. 경험상, 세포 수 대비 배지의 양이 증가하면 NO가 희석되서 농도 측정이 어렵습니다.

마지막으로, LPS stock이 보관상태가 좋지 않아서 세포를 충분히 자극하지 못한 경우입니다. 저는 통상 PBS나 media에 1mg/mL 스톡을 만들고, -20도 냉장고에 보관했는데, 50~100uL씩 여러 tube에 분주해서, 한두번 얼렸다 녹이면 버렸습니다. 얼렸다 녹이면 LPS 활성이 떨어집니다. 냉장보관하셔도 활성이 떨어집니다. 장기간 (경험상, 3~6개월 이상) 냉동보관하셔도 활성이 떨어질 수 있습니다. 따라서, LPS stock 을 잘 만들었는지 1차로 확인한 이후부터 실험을 들어가는게 좋습니다.

3. 전반적으로, 실험을 위한 최적 조건이 잡히지 않은 상태로 보입니다. 이 상태에서 COX-2 경향을 논하는 것은 머리만 복잡해집니다. 실험 조건부터 확실히 잡고 나서 재실험해보셔요.

 

몇 가지 주의사항을 말씀드리자면,

FBS를 heat-inactivation하지 않는 경우, FBS를 filtering하지 않는 경우 모두 RAW cell을 activation시키는 원인이 됩니다. 배지를 만들 때 주의하셔요.

또한, trypsin을 처리해도 activation됩니다. RAW cell 은 scraper로 긁어서 계대배양을 하는 세포입니다. 2~3일에 1번, T75 flask에서 full confluency 기준으로 1/10 (약 2~3x10^6 cell) 계대해줘야 세포가 동글동글하게 유지됩니다. 만일, 현미경으로 관찰시, 세포가 바닥에 쫙 달라붙어있는 모습이 보이면, 그게 RAW cell 이 macrophage로 분화, activation된 상태입니다. activation된 세포가 많이 눈에 띄지 않도록 세포주 관리에 주의해주세요. 

알나의세계로  |  08.22 23:23  

다 필요없고 그냥 cell stock 한거 풀어서 sub culture 여러번 진행 (3회 정도) 하고 LPS 처리하면 됨.

sub culture 할 때 최대한 부드럽게 pipetting 해주고 up&down 도 천천히 벽에 대어서 부드럽게.. cell 의 입장이 되어서 최대한 스트레스 안주고 culture 해보셈

올챙이기웃기웃  |  08.23 15:22  
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