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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 ponceasu 염색 후 membrane이 이상해요..
알dwre(대학원생)  |  08.17 19:42
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제목 그대로입니다 ㅠㅠ

총 6개 샘플 내린건데... marker 바로 옆 샘플 두개가 위에서 저렇게 번지는듯한 모양을 보여요

나머지 그렇지 않은 샘플들은 b-actin 포함해서 다 band detection이 되는데

저렇게 번지는 듯한 모양을 보이는 샘플들은 band가 아예 안뜨더라구요....

 

단백질 정량은 BSA 희석액 이용해서 standard curve로 계산했습니다.

R2값은 0.99이상이었구요..

단백질 양은 다 같이 30 ug loading했습니다. (같은 target protein을 측정한 선행연구에서 30~40 ug을 로딩했길래 저도 30 ug을 로딩했습니다.)

13% gel 만들어서 사용했고 50 V 30분, 120V 1시간 전기영동했습니다.

transfer는 wet 방식으로 80V 2시간 PVDF membrane으로 진행했습니다.

답변 주시면 감사하겠습니다..

#Western blot
 
#ponceasu
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전기영동 할 때 marker 옆 2개 lane의 BPB line이 수평으로 잘 내려가던가요?

대왕개구리SPEED  |  08.17 19:55  

먼저 SDS-PAGE를 하고 쿠마시 염색을 해 보세요.

각 생플이 적정 농도인지와 밴드들이 잘 나오는지를 먼저 확인하고 나서 웨스턴을 하세요.

농도가 제각각이면 농도를 맞추고, 밴드가 앙망이면 정제를 하던가 샐 준비하던가 등의 과겅이 필요합니다.

실험은 아무리 잘하는 사람이라도 각 단계를 하나하나 확인하면서 진행해야 합니다. 중간에 하 단계씩 확인을 안하고 진행하면 결과가 안나오거나 이상하게 나올때 트러블슈팅을 하기가 어렵습니다.

대왕개구리강시  |  08.17 20:55  

SPEED님, 


marker를 제외한 빈 well  sample 모두 수평으로 내려가긴 하는데, 1cm 정도로 두껍게 내려왔습니다..

빈 well에는 5X sample buffer, RIPA buffer를 1:1로 섞어 sample과 같은 부피를 loading하였습니다.

근데 이건 ponceasu에서 괜찮게 나온 lane, 아닌 lane 모두 비슷한 양상을 보였습니다.
 

알dwre  |  08.19 16:30  

빈 well은 뭔가요?

그리고 빈 well이 5X sample buffer, RIPA buffer를 1:1로 섞어

sample과 같은 부피를 loading 했다면 다른 well은 어떻게 했나요?

대왕개구리SPEED  |  08.19 16:37  

SPEED님!

샘플을 로딩하지 않은 well을 빈 well이라고 지칭한 것이고, 

샘플이 없는 lane에는 모두 5X sample buffer : RIPA buffer를 1:1 비율로 섞어 loading하였습니다.

 

알dwre  |  08.19 21:12  

빈Well 외의 well은 어떻게 혼합해서 loading했습니까?

그리고 멤브레인 염색이 저렇게 나왔다면 저 lane이 있는 부분은

gel과 유리판사이에 틈이 벌어졌을 겁니다.

따라서 마커쪽으로 단백질이 퍼져있는걸 볼수있습니다.

이것은 transfer 문제가 아니라 전기영동 문제라고 보여집니다.

그러나 전기영동이 잘되지 않아도 분자량 위치는 다르지만 band가 잡혀야

정상입니다.

문제가 되는 lane은 다른 lane보다 중간 이후의 단백질이 거의 안보이기 때문에

단백질 분리에 문제가 있어 보입니다.

항상 전기영동 할 때 부터 BPB lane이 다 내려갈때 까지 한번씩 확인도 하고

사진도 찍어 놓는것이 문제 해결에 도움이 될겁니다.

 

 

대왕개구리SPEED  |  08.19 21:32  
첨부파일 파일첨부: 1234.jpg (719 KB)
이미지 첨부파일

SPEED님,

sample은 총 30 ul을 loading 하였고, 
5X sample buffer 6 ul
sample은 30 ug을 loading하는 부피
그리고 RIPA buffer로 35 ul을 맞추었습니다.

문제의 lane들은 왼쪽부터 
sample lysate 8.82 ul + RIPA buffer 15.18 + 5X sample buffer 6
sample lysate 8.41 ul + RIPA buffer 15.59 + 5X sample buffer 6
로 로딩하였습니다.

단백질 분리에 문제가 있다면 어떻게 해야할까요??
전기영동 조건을 120V, 110V, 100V로 바꾸어보아도 항상 같은 현상이 나타납니다...

같은 조건으로 다시 gel을 내려보고 쿠마시 염색을 해보았을 때, 첨부한 사진과 같이 나타나서 확실히 전기영동 단계에서 문제가 있는 것 같긴 합니다만.....ㅠㅠ

알dwre  |  08.20 16:42  

CBB 염색한 위의 gel에서 제일 오른쪽 marker를 제외한 lane의 설명을

부탁합니다.

upload_image

대왕개구리SPEED  |  08.20 17:30  
첨부파일 파일첨부: 56.jpg (90 KB)
이미지 첨부파일

SPEED님,

 

1,2,3,4의 왼쪽, 염색이 되지 않은 lane에는 샘플을 로딩하지 않고 RIPA buffer : 5X sample buffer = 1:1로 섞어 로딩하였습니다. 

 

쿠마시 염색 사진의 1,2 lane은 제가 본문에 올렸던 사진의 5,6번 sample과 같은 처리를 한 다른 샘플이고,  (주황색 선)

 

쿠마시 염색 사진의 3,4 lane은 본문 사진의 1,2 lane과 같은 샘플입니다. (초록색 선)

알dwre  |  08.20 19:08  

1. 1, 2번 lane의 시료는 같은 겁니까?

2. 그리고 시료는 새로 만든건가요 아니면 앞전에 만들어 놓은 걸 사용했나요?

3. 1&2와 3&4 시료는 동물세포 lysate인가요?

4. 동물세포라면 lysate는 어떤 방법으로 만드나요?

이번 gel은 전기영동에 문제는 없습니다.

전기영동 문제가 아니라 lysate 만드는 방법을 한번 검토를 해보는것이

좋을 듯합니다.

대왕개구리SPEED  |  08.20 19:44  

1. 같은 sample은 아니고 같은 마우스에서 분리한 세포에 물질을 다른 농도로 처리한 후 lysis 한 시료입니다. 


2. 쿠마시 염색과 ponceasu 염색의 시료는 다른 것(개체가 다릅니다)이고, 같은 처리를 한 샘플입니다.


3. 1,2는 동물세포 lysate이고 3,4는 간 조직 lysate입니다. 


4. 세포 배양 후 원심분리하고, 상층액은 따로 저장했습니다. 이후 배지로 2회 washing하여 세포만 회수하였고 다시 원심분리하여 배지를 제거하고 RIPA buffer를 넣어주고 30분간 ice에서 incubation하였습니다. 이후 12000 rpm, 20분, 4oC로 원심분리하였고 상층액만 분리하여 사용한 것입니다..  

알dwre  |  08.21 08:46  

cell lysis 중 protease inhibitor cocktail은 안 넣나요?

안넣었으면 넣어주세요.

그리고 cell은 100% lysis가 되는지 확인 후 원심분리하나요?

1, 2번 lane은 cell lysate pattern이 아니고 30ug/lane이 안되는것 같습니다.

cell lysate를 정확히 만들고 나서 SDS-PAGE에서 정상적으로 나온 후western을

진행하는 것이 좋을 듯합니다.

 

 

대왕개구리SPEED  |  08.21 12:21  
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