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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 도움을 부탁드려요!! ㅠㅠㅜ RT-PCR (reverse transcription PCR) 결과와 realtime PCR의 결과가 일치하지 않을수 있는가요??
알사브레(대학원생)  |  2019.08.16 17:29

안녕하세요 ! 저는 모 대학에서 석사과정 중인 학생입니다.

 

3T3-L1을 이용하여 약물을 처리한 후 웨스턴블랏과 RT-PCR, realtime PCR로 결과를 확인하는 중인데요, 

 

웨스턴블랏에서 약물을 처리하였을 때 감소하는 결과를 얻었고 RT-PCR에서는 줄어들지 않는 결과를 얻었으나 realtime PCR에서는 웨스턴 블랏처럼 줄어드는 결과를 얻었습니다. 

제가 궁금한 부분은, 'RT-PCR (reverse transcription PCR) 결과와 realtime PCR의 결과가 일치하지 않을수도 있는가?'라는 점입니다. 두 실험 모두 같은 cDNA를 사용하였고 다른 점이라면 사용한 cDNA의 농도 뿐인데 이것은 영향을  미치지 않는 것 같습니다. (RT-PCR에서 사용한 cDNA농도의 절반 농도를 realtime PCR 에 사용하였습니다!! realtime PCR 할 때의 final concentration 때문....)

그래서 realtime PCR에서는 줄어들었던 샘플을 well에서 따서 다시 아가로즈겔에 전기영동을 해보았더니 RT-PCR의 결과와 같은 방향으로 줄어들지 않는다는 결과가 나왔습니다. 

realtime PCR의 결과를 믿어야 할까요 RT-PCR의 결과를 믿어야 할까요...?

아니면 이런 상황에서 제가 다시 체크해 볼 수 있는 방법이 있을까요??

혹시 제가 하는 realtime PCR의 데이터 처리 과정에 문제가 있는걸수도 있을까요...?

 

도움을 부탁드려요!

 

 

#RT-PCR
 
#q-PCR
 
#realtime PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.08.16   

결론적으로 RT-PCR과 qPCR은 별개의 실험으로 결과가 일치하지는 않습니다.

RT-PCR로 만든 수많은 cDNA 가닥에서 target gene의 전사량을 확인하기 위해서

qPCR을 하는 것입니다.

따라서 RT-PCR과 qPCR은 비교 대상의 실험이 아닙니다.

예를들어 cell lysate에서 total protein 중에서 target protein의 발현양을 확인하기

위하여 western으로 확인하는 것입니다.

qPCR에서 mRNA 전사량을 측정하기위하여 역전사된 DNA가 필요하기 때문에

RT-PCR은 mRNA 가닥들을 cDNA로 만드는 역할을 할 뿐입니다. 

이때 RT-PCR 후 target gene의 mRNA만 cDNA로 만들어지는 것은 아니며

cDNA 합성 수율에 문제가 없는지 한번 살펴보는 것이 좋을 듯합니다.

결론적으로 western blot과 qPCR의 결과는 일치해야 하면 RT-PCR은 별개의

실험입니다.

개구리무광  |  2019.08.17   

WB와 qPCR에서 줄어 들었다면 줄어드는게 맞는 것 같습니다.

PCR 돌린 cycle 수가 너무 높은 것 같습니다. (혹은 dNTPs 양이 적거나)
template 농도가 어떻던 cycle 수가 너무 높으면
결국 넣어준 dNTPs 모두 합성되므로 최종 농도는 같아집니다. 

qPCR에서 template 농도가 몇 몇십배 차이나더라도 
결국 최종수치는 같은 곳에 수렴하는게 그 이유이지요.

애초에 RT-qPCR이 PCR의 번거로운 optimization 과정을 거치지 않아도
신뢰성있는 결과를 얻을 수 있기 때문에 선호되는 실험입니다.

RTqPCR에서 재현성있는 결과를 얻었는데
굳이 RTPCR로도 확인할 필요가 있는지는 의문입니다만
RTPCR 데이터를 굳이 얻고 싶으시다면
PCR cycle 수와 template농도를 샘플당
1, 4x, 16x 정도로 3 lane 내려보면서 최적 조건을 찾아야합니다.

ㅇㅇ  |  2019.08.19    

RT-PCR의 샘플과 qRT-PCR의 샘플을 로딩했을 때 차이가 안 보이는건 saturation 됐기 때문입니다.

RT-PCR시 cycle을 조정하거나 중간 중간 prep. 해보시면 다른 것을 보실 수 있을 거예요.

보통 qRT-PCR 전에 RT-PCR로 러프하게 확인할 때, 잘 떠지는 샘플들은 50 ul rxn 하면서 20, 25 cycle 정도에서 5 ul씩 빼가면서 돌린 후에 한 번에 로딩합니다.

해보시면 알겠지만 30에선 차이가 안 보여도 20, 25에서는 확연히 다르게 보입니다.

같은 이유로 actin도 너무 많이 돌리시면 안 되요. 30 cycle만 돌려도 다 똑같이 보이거든요. 컨트롤은 최대한 적은 cycle로 돌리는 것이 좋습니다. WB에서 exposure를 적게하는 것처럼요.

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