[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
https://www.ibric.org/myboard/list.php?Board=news&PARA3=54
스폰서배너광고 안내  배너1
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
조회 1432  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 도움을 부탁드려요!! ㅠㅠㅜ RT-PCR (reverse transcription PCR) 결과와 realtime PCR의 결과가 일치하지 않을수 있는가요??
알사브레(대학원생)  |  2019.08.16 17:29

안녕하세요 ! 저는 모 대학에서 석사과정 중인 학생입니다.

 

3T3-L1을 이용하여 약물을 처리한 후 웨스턴블랏과 RT-PCR, realtime PCR로 결과를 확인하는 중인데요, 

 

웨스턴블랏에서 약물을 처리하였을 때 감소하는 결과를 얻었고 RT-PCR에서는 줄어들지 않는 결과를 얻었으나 realtime PCR에서는 웨스턴 블랏처럼 줄어드는 결과를 얻었습니다. 

제가 궁금한 부분은, 'RT-PCR (reverse transcription PCR) 결과와 realtime PCR의 결과가 일치하지 않을수도 있는가?'라는 점입니다. 두 실험 모두 같은 cDNA를 사용하였고 다른 점이라면 사용한 cDNA의 농도 뿐인데 이것은 영향을  미치지 않는 것 같습니다. (RT-PCR에서 사용한 cDNA농도의 절반 농도를 realtime PCR 에 사용하였습니다!! realtime PCR 할 때의 final concentration 때문....)

그래서 realtime PCR에서는 줄어들었던 샘플을 well에서 따서 다시 아가로즈겔에 전기영동을 해보았더니 RT-PCR의 결과와 같은 방향으로 줄어들지 않는다는 결과가 나왔습니다. 

realtime PCR의 결과를 믿어야 할까요 RT-PCR의 결과를 믿어야 할까요...?

아니면 이런 상황에서 제가 다시 체크해 볼 수 있는 방법이 있을까요??

혹시 제가 하는 realtime PCR의 데이터 처리 과정에 문제가 있는걸수도 있을까요...?

 

도움을 부탁드려요!

 

 

#RT-PCR
 
#q-PCR
 
#realtime PCR
답변하기
검색광고 검색광고
[(주)엔지노믹스] 엔지노믹스에서 믿을 수 있는 고품질의 PCR 효소를 구매하세요.
Routine PCR, High-performance PCR, High-fidelity PCR, Hot-start PCR, RT-PCR, Real-time PCR(qPCR) 연구원이 필요한 모든 PCR Polymerase 가 준비되어 있습니다. 지금 바로 문의하세요. TEL: 042-719-1023 / E-mail: info@enzynomics.com
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.08.16   

결론적으로 RT-PCR과 qPCR은 별개의 실험으로 결과가 일치하지는 않습니다.

RT-PCR로 만든 수많은 cDNA 가닥에서 target gene의 전사량을 확인하기 위해서

qPCR을 하는 것입니다.

따라서 RT-PCR과 qPCR은 비교 대상의 실험이 아닙니다.

예를들어 cell lysate에서 total protein 중에서 target protein의 발현양을 확인하기

위하여 western으로 확인하는 것입니다.

qPCR에서 mRNA 전사량을 측정하기위하여 역전사된 DNA가 필요하기 때문에

RT-PCR은 mRNA 가닥들을 cDNA로 만드는 역할을 할 뿐입니다. 

이때 RT-PCR 후 target gene의 mRNA만 cDNA로 만들어지는 것은 아니며

cDNA 합성 수율에 문제가 없는지 한번 살펴보는 것이 좋을 듯합니다.

결론적으로 western blot과 qPCR의 결과는 일치해야 하면 RT-PCR은 별개의

실험입니다.

개구리무광  |  2019.08.17   

WB와 qPCR에서 줄어 들었다면 줄어드는게 맞는 것 같습니다.

PCR 돌린 cycle 수가 너무 높은 것 같습니다. (혹은 dNTPs 양이 적거나)
template 농도가 어떻던 cycle 수가 너무 높으면
결국 넣어준 dNTPs 모두 합성되므로 최종 농도는 같아집니다. 

qPCR에서 template 농도가 몇 몇십배 차이나더라도 
결국 최종수치는 같은 곳에 수렴하는게 그 이유이지요.

애초에 RT-qPCR이 PCR의 번거로운 optimization 과정을 거치지 않아도
신뢰성있는 결과를 얻을 수 있기 때문에 선호되는 실험입니다.

RTqPCR에서 재현성있는 결과를 얻었는데
굳이 RTPCR로도 확인할 필요가 있는지는 의문입니다만
RTPCR 데이터를 굳이 얻고 싶으시다면
PCR cycle 수와 template농도를 샘플당
1, 4x, 16x 정도로 3 lane 내려보면서 최적 조건을 찾아야합니다.

ㅇㅇ  |  2019.08.19    

RT-PCR의 샘플과 qRT-PCR의 샘플을 로딩했을 때 차이가 안 보이는건 saturation 됐기 때문입니다.

RT-PCR시 cycle을 조정하거나 중간 중간 prep. 해보시면 다른 것을 보실 수 있을 거예요.

보통 qRT-PCR 전에 RT-PCR로 러프하게 확인할 때, 잘 떠지는 샘플들은 50 ul rxn 하면서 20, 25 cycle 정도에서 5 ul씩 빼가면서 돌린 후에 한 번에 로딩합니다.

해보시면 알겠지만 30에선 차이가 안 보여도 20, 25에서는 확연히 다르게 보입니다.

같은 이유로 actin도 너무 많이 돌리시면 안 되요. 30 cycle만 돌려도 다 똑같이 보이거든요. 컨트롤은 최대한 적은 cycle로 돌리는 것이 좋습니다. WB에서 exposure를 적게하는 것처럼요.

답변하기
할인행사 광고 검색광고
코람바이오텍 코람바이오텍
[OriGene] IHC Reagents, shRNA, CRISPR, Proteins, Lentivirus.. (4.27까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
Eppendorf New 25mL Conical Tubes : 혁신적인 디자인과 다양하고 편리한 사용 (4.1까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
βeta
3/6  좌우
404,600384,000
102,30097,000
153,000145,000
691,800657,000
239,800228,000
522,300496,000
90,60086,000
121,100115,000
242,000230,000
71,30068,000
625,100594,000
272,300259,000
867,100824,000
79,70076,000
225,200214,000
158,400150,000
119,600114,000
147,600140,000
374,800356,000
316,000300,000
92,80088,000
603,600573,000
140,100133,000
199,100189,000
최근등록   더보기 >
knock out 마우스 국내보유 검색방법   02.23
3M petri dish를 사용한 미생물 측정 방법 (대장균, 일반세균용)   02.23
발효액 안에서 미생물 추출   02.22
손세정제를 소독용 에탄올 대신으로 써도 될까요?   02.22
Desoxycholate Lactose Agar 배지 색 변함   02.22
ImageJ mean gray value 질문입니다   02.22
단백질 농도 측정 시 계산 법   02.22
코로나19 같은 바이러스 관련 실험문의입니다!!(급합니다ㅜ)   02.22
세포가 오염돼서 죽은 거 같아요   02.21
mouse 실험에 적당한 전기자극은 어느정도일까요?   02.21
에스엘에스바이오
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아