실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Purification/Isolation
에탄올 ppt후 녹지 않는 침전물이 생깁니다. 제발 도와주세요 선배님들!!!
레벨2 해태 (과기인)
안녕하세요 선배님들.
제가 에탄올ppt로 DNA농도 농축을 하는데, ppt 후에 계속 녹지 않는 pellet이 존재합니다. (불투명한 침전물)isopropanol로 ppt하여도 동일합니다.
shaking을 정말 오랜시간 해도 사라지지 않더라고요... pellet을 70%에탄올 워싱후에 DW로 녹이면 잘 녹지 않고, shaking해주면 거의 1시간(?)에 걸쳐 녹다가 결국 녹지 않는 침전물들이 존재하게 됩니다. 막같은 침전물이 떠다니는데 신기한게 electrophoresis 하면 밴드는 정상적으로 나옵니다.
밴드는 정상이지만 파이펫팅 시 피펫 팁을 막을정도로 큰 침전물들이라 그냥 사용하기에는 무리가 있는 것 같고.. 어떻게 하면 침전물이 생기지 않게 ppt 할 수 있을까요?
제가 실험하는 과정이
plasmid prep(마지막에 buffer아닌 DW로 내림)을 enzyme cut한 뒤에
에탄올ppt를 하고 있는데, 혹시 prep후에 바로 ppt를 하지 않고 enzyme cut까지 진행하여 염이 너무 과한상태라 ppt시 저런 침전물이 생기는걸까요.
혹 이런경우가 있으셨거나 짐작가는 부분이 계시다면 알려주시면 감사하겠습니다.
prep후에 에탄올 ppt를 바로 하지 않는 이유는 농도손실이 우려돼서 입니다. 그리고 gel extraction으로 정제하는 방법은 kit tube 1개당 DNA 10ug까지만 커버가 가능하더라고요. 저희 실험실이 DNA를 정말 많이 사용하는 실험실이라 한번 ppt할 때 마다 100ug정도 되는 양을 정제하려 하는지라 gel extraction은 힘들 것 같습니다.
>사실 에탄올ppt 하려는 목적이 정제도 있지만 워낙 많은 DNA를 enzyme cut 하다 보니 부피가 많이 늘어나서 농축하려는 의도가 더 큽니다.
제가 한 실험방법 입니다.
1. enzyme cut 한 plasmid volume의 1/10 만큼 3M sodium acetate를 넣어준다
2. enzyme cut 한 plasmid volume의 2배 만큼 ethanol을 넣어준다 (isopropanol은 1배)
3. 냉동실에 1시간 보관
4. centrifuge 10000G, 0'C, 10min (하고나면 하얀 pellet이 생깁니다)
5. 상층액 버리고 남은 액체 피펫으로 떠서 버린다
6. 70% ethanol 500uL 넣고 다시 10000G, 0'C, 10min
7. 상층액 버리고 남은 액체 피펫으로 떠서 버린 뒤 튜브를 거꾸로 뒤집어서 ethanol 모두 말리기
8. 7번 튜브에 DW를 넣고 묽혀준다 (이 과정에서 녹지 않는 침전물이 생깁니다.)
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