1. 어떤 균주 인지를 알려주셨다면 답변이 더 쉬웠을 것 같습니다. 실험실에서 유전자를 다루는 목적으로 일반적으로 사용하는 대장균을 말씀 하시는 것이면 고체 배지에 1~2회 긁어서 single cell isolation 후 알고 계시는 C.P. cell 제작 방법에 사용하시면 됩니다. 바로 액체 배양으로 가는 것은 추천드리지 않습니다. 

2. 어떤 제한효소를 사용하시는지 알려주셨다면 이 또한 답변이 쉬웠을 것 같습니다. 먼저, 제한효소의 상태, 유전자(plasmid) 상태 등 실험적으로 고려할 사항을 더 점검해 보시는 것이 좋을 것 같습니다. 

compatible cohensive end을 이용해서 ligase시킨 경우는 다시 자르면 잘리지 않습니다. 

예를 들어 vector에 xhoI으로 집어넣으려고 하는데 GOI 안에 xhoI이 있다면 enzyme site를 salI으로 바꿔서 GOI를 잘라주고 vector에 ligation을 시켜주면 vector에 원하는 gene을 집어 넣을수 있습니다. 하지만 이 후론 xho/sal 모두 잘려 나오지 않게됩니다. 

혹시 plasmid를 받아 오신것이라면 이것도 한번 확인해 보세요.