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일단 용어를 좀 더 명확히 해주셨으면 하는 바램이 있습니다.
standard는 무엇인지요?
endogenous gene을 보통 저는 그렇게 부르는데, 여기서는 mock cloning인가요?
같은 plasmid에서 rna prep하고 cDNA를 동일하게 만든건가요?
일단, endogenous gene에 대한 언급은 없으니, (comparative delta ct method도 standard는 각각 필요합니다. 두 gene에 대해서요)
제가 이 상태에서 보기에는 rna prep. 후 cDNA 합성이 문제인것 같습니다. REAL TIME은 RT와는 달라서 expotential curve앞에서 초기의 DNA의 quality가 굉장히 중요합니다. molecular beacon method든 intercalation method든 마찬가지입니다. 특히 후자의 경우 더 중요하죠. 워낙 specification이 떨어지니깐요.
일단, nano에서 260/280과 260/230 ratio가 얼마인지 모르겠군요. solvent의 함유 (예를 들어, phenol이나 buffer)에 따라 230 ratio가 달라지니깐요.
일단 rna를 cDNA 합성전에 한번 purification하시길 권합니다. 간단합니다.
키트있으시면 쓰시면 되고, 없으시면, 마지막 prep후에
1) 뽑아놓은 rna를 DEPC-water 200ul
2) 3M sodium acetate 20 ul
3) absolute EtOH 400 ul
1_3)을 섞은후 5분정도 믹싱해준 후에 딥프리저에서 o/n합니다
다음날 와서 12000rpm 4도 15분 centri한후에 pellet만 남기고 sup은 버립니다. dry한후 다시 적량의 DEPC에 녹인후 RT진행하십시요.
GOOD LUCK