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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 autophagy와 cancer 전문가님들께 질문
알naa(대학원생)  |  2019.08.07 23:09
autophagy 유도 약물로 실험하고있는 석사과정 학생입니다

먼저 약물처리한 후 cell proliferation(viability) test에서 감소하는 cell과 영향이 없는 cell을 확인하고
western blot으로 LC3-ll를 봤더니 cell proliferation에서 영향이 있든 없든 모두 LC3-ll가 증가했습니다
cancer cell은 HCC(간암세포주) 사용중입니다!

1. autophagy도 cell death중 하나니까 proliferation test에서 감소한 cell들만 LC3-ll가 증가해야하는 것이 아닌가요?? 왜 영향이 없는 cell들도 증가했을까요,,?

2. autophagy도 cell death중 하나이니 autophagy가 증가하면 암세포를 죽이는데 효과가 있는것이라 생각했는데
좀더 공부를 해보니 보통 autophagy inhibitor가 암세포를 죽이는데 쓰이더라고요.. autophagy inducer는 암세포를 죽이거나 암세포 성장을 억제하는 쪽으로는 쓰이지 않나요?? 계속 찾아도 찾기가 힘드네요ㅠㅠ

autophagy 전문가님들 도와주세요!!
#autophagy
 
#autophagy inducer
 
#cancer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리무광  |  2019.08.08   

1. 작성자께서 어떤 기전을 가지고 있는 약물처리를 하신지에 따라 다양한 의견이 나올 것 같습니다.

2. 일단 Autophagy가 반드시 암을 억제하지는 않습니다. 암세포가 되기전 정상 세포에서는 Autophagy가 cellular homeostatsis에 중요한 역할을 담당하므로 암 억제기전으로서 주로 작용하는 것으로 알려져 있긴하지만, 당연히 절대적인 것은 아닙니다.
또한 암세포의 경우, 많은 암세포주에서 증식을 위한 영양, 에너지공급의 메커니즘의 하나로서 Autophagy가 작용하는 경우가 보고 되고 있습니다.

autophagy, cancer, review로 구글링하시면 많은 리뷰들이 있으니 읽어보시면 많은 도움이 되실 것 같네요.

Castiel  |  2019.08.08    

안녕하세요. 제가 아는 지식으로는 우선 선생님께서 Autophagy를 왜 target으로 잡고 하시는지와 현재 HCC에서 어떤 Cell line을 가지고 실험하는지 비슷한 논문을 찾아보시고 실험 하시는게 좋을 것 같습니다.

제가 선생님 이라면.

1. Cell 상태를 우선 확인한다. Culture 만 하는 cell에서 얼마나 cell들이 떠 다니는지 확인. 최대한 현미경 확대해서 세포가 동글한지와 세포안에 기포처럼 생긴게 있는지 확인한다.  Cell 상태가 좋으면 계속 사용하고, 안좋으면 새로 stock 풀어서 다시 실험을 시작한다.

2. 약물을 농도별로 쳤는지 확인. 예)5, 10, 20, 40uM     

3. 약물을 24h, 48h, 72h까지 time course 했는지 확인.

4. Western bolt 하실때 Protein 농도를 10ug, 20ug  으로  따로 정량해서 12% page gel로 Loading 볼트는 80v로 천천히 내리세요. LC3-II 사이즈가 작아서 빨리 내리면 밴드가 흐려지거나 이쁘지가 않음.  Bio-rad 쓰시면 대략 2시간 반에 Loading 됨. transfer하시고 1차붙이시고 담날 2차붙이시고 밴드 찍으실때 20sec 30sec 50sec 1min 이런씩으로 밴드 확인하시고 찍으시면서 확인.

5. 그래도  LC3-II 가 똑같이 나온다. Apoptosis 관련 PARP 나 cas-3 or creaved cas-3로 확인해봄.  같은 셈플로 사용해서 확인.  이땐 8%,12% SDS-PAGE gel 사용. 

둘다 아니면 논문 찾아보고 포닥분이나 교수님과 상의를 해보고 실험을 진행한다.

이건 저의 주간적인 생각이니 참조하시고 좋은 결과 있으시길 바라겠습니다. ^^                                            

 

  

알check  |  2019.08.12   

1. autophagy도 cell death중 하나니까 proliferation test에서 감소한 cell들만 LC3-ll가 증가해야하는 것이 아닌가요?? 왜 영향이 없는 cell들도 증가했을까요,,?

--> autophagy는 cell death 중 하나가 아닙니다.

--> LC3 II 로의 conversion은 약물 처리와 무관하게 세포의 상태에 따라서 얼마든지 일어날 수 있습니다. 실험에 사용한 세포의 상태부터 확인해 보시는 것이 좋겠습니다.

 

 

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