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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR관련해서 질문이 있습니다...ㅠㅠㅠ
알kms5057(대학생)  |  2019.08.05 22:00

제가 한 실험이 아니어서 사진이 없지만 궁금한 점이 생겨서 물어봅니다.

foward, reverse primer가 대략 60도 정도 였고

그것에 맞춰서 annealing 온도를 57, 60, 63으로 맞춰서 했는데

63도에서 target dna 이외의 band가 다른 온도에서 보다 더 여러개 그리고 진하게 나타났습니다. (크기를 확인했을 때)

온도가 높아지면 특정 부위에 더 잘 붙고 다른 band가 더 잘 나오는 게 아닌가요??

왜 그런지 궁금합니다.

#PCR
 
#DNA
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대왕개구리SPEED  |  2019.08.05   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

일반적으로는 질문과 같은 현상을 보이지만 반드시 그런것은 아닙니다.

57, 60, 63도를 비교해 봐야 정확인 알수 있을 것 같고 만약 57도 에서 single band로

증폭이 잘된다면 57도 보다 온도를 내리면 비특이 band가 나올 가능성이 높고

57도 보다 온도를 올리면 band 증폭양이 줄어드는 경향이 있지만 어디까지나

이론적인 내용입니다.

 경험으로 봤을 때 single band가 잘 나오는 온도가 있다면 온도를 내리거나

온도를 올리거나 single band로 증폭이 잘된것 같습니다.

현재 57, 60, 63도 에서 single band로 증폭이 잘되는 온도는 어느 온도인가요?

알kms5057  |  2019.08.06   

57에서 가장 잘 나온 것으로 알고 있습니다.

57>60>63 순으로 많이 나왔고 63은 거의 target DNA가 나오지 않았고 다른 band가 더 많이 나왔습니다.ㅜㅜㅜㅜ

 

bioreacter  |  2019.08.10    

band가 여러개 보이는 것은 잘 아시다 시피 비 특이적으로 다르 region에도 binding 하기 때문 입니다. 

보통 이론 적으로 melting temperature보다 더 높일 수록 이러한 현상이 감소 한다고는 하지만 primer sequence를 한번 더 확인해 보시는 것이 어떠신지요?

primer design이 잘 되지 않거나 universal한 primer 사용하신다면,

온도는 원하는 band size만 나오는 조건에서 elongation time을 1kb = 1min기준으로 하되 약간 단축 시켜서 테스트 진행해 보셔도 될듯 합니다. 

band는 거짓말을 하지 않는다고 개인적으로 밑고 있고 이에는 항상 원인이 있기 때문에 더 예쁜 그림을 원하신다면 당연하다고 생각했던 부분을 다시 생각해보시는 것도 좋을 듯 합니다. 

PCR condition을 한 번 더 확인해보시는 것이 좋을 듯 합니다. 

 

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