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 전체 > Molecular Biology-DNA > DNA Modification
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질문 Cripr/cas9 system으로 Knockout cell line을 만들었는데요
알목성인이다(대학생)  |  2019.08.01 15:16

제가 원하는 Target Oligo 서열을 lenticrispr v2 BsmbI 로 Digestion 하여 ligation 시켜서 raw 264.7 cell에 transfection 시켜 antibiotic selection을 거쳐서 single colony를 얻어서  western으로 단백질 발현이  안되는 것을 확인한다음에 primer 디자인을(타켓시퀀스-120~+350 떨어짐) 해서 PCR Product를 시퀀싱 한 결과,.... 아예 WT과 시퀀싱이 (패턴, 피크, 시퀀스 전부 다) 동일하게 나왔습니다... 분명 웨스턴 블랏해서 (단백질 발현이 되게 Agonist 처리하고) 단백질 발현이 안된다는것을 확인했는데......

 

무엇이 문제일까요 Trouble shooting을 뭘 해야할까요.(KO Strain stock만들어논게 있는데 그걸 다시 한번 PCR확인해볼까요)

PS. 다시 한번 서열을 확인해보니 제가 타겟한 올리고서열에서 좀 멀리 떨어진 곳에서 패턴이 다르다는걸 확인하였는데 이것이문제였을까요?(300bp 정도...)

미치겟네요......ㅠㅠ

#CRISPR Cas9
 
#Sequencing
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