실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
Cloning 과정에서 어떤 부분이 잘못되었는지 찾고 싶어요~
레벨1 jinnyjinny (일반인)
안녕하세요
DNA cloning을 하면 매번 결과가 좋지 않아 그 원인을 찾고싶은 초보자입니다.
*6X TOPcloner buffer 0.5μl
pTOP cloner Vector 0.5μl
purified PCR product 0.5μl or Control Insert DNA 0.5μl
D.D.W. 1.5μl
위의 비율로 Gel purification을 한 DNA와 Control Insert DNA (Ligation control)를 넣어 Ligation을 진행한 뒤 따로 pUC19 control plasmid를 추가로 준비하여, 각각에 DH5α를 넣고 ampicillin(항생제)를 넣어 만든 고체배지에 도말하여 배양을 했더니, 콜로니 수가 Ligation contol과 Plasmid control꺼는 많이 생겼는데 DNA꺼는 엄청 적었습니다.
그럼에도 콜로니 하나씩 따서 항생제가 든 액체배지2ml에 액체배양을 했더니 뿌옇게는 되었지만 플라스미드 추출결과 플라스미드가 뜨지 않았습니다.
플라스미드 추출의 핸들링 문제는 아닌걸 확인했어서, Ligation이 문제인지, 항생제가 문제인지, Gel purification의 문제인지 어떤 부분에서 잘못되었는지 궁금합니다. 이걸 알아내기 위해 어떤 테스트를 해봐야하는지도 궁금합니다ㅠㅠ
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