[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 sale 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
검색광고안내
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
조회 1337  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 enzyme cut 한 후에는 band size가 정확한데 gel elution만 하면 size가 낮아집니다.
알마이어(대학원생)  | 2019.07.26 18:36

안녕하세요 분자유전학을 공부하고있는 대학원생입니다.

제가 요즘 cloning 실험 중인데 3번째 시도 중인데 계속 같은 증상이 나와서

조언을 좀 듣고자 질문드립니다.

 

제가 최종적으로는 Yesat two hybrid를 계획중이라 sequencing을 하기위해서 2700bp정도 되는 TA vector에 insert로 1800bp정도 되는 DNA를 삽입시켜 놨습니다.

그 후에 sequence가 맞는 vector를 midiprep하여 추출하고 제가 insert DNA 앞뒤에 붙여논 EcoRI site와 BamHI site를 자르고, Y2H를 위한 pGBKT7 vector에도 같은 site를 자르기 위해서

총 50 ul volume에 TA vector DNA 6 ug, EcoRI-HF 0.5ul(10 unit), BamHI-HF 0.5ul(10unit), cutsmart buffer 5ul, 나머지는 DW를 넣고 4시간 37도에서 incubation 시킨 후 1ul 만을 따서 DW와 섞어 gel을 내려 봤습니다. 

 upload_image

그 결과 사진이 이렇게 나왔습니다

제일 왼쪽이 size marker인데 제일 밑에 부터 500, 1000, 2000, 3000이렇게 이고 가장 위쪽이 10k, 8k, 6k입니다. 

그래서 2,3번째 2개가 제가 각각 삽입해놨던 TA vector의 결과이고, 4번째가 pGBKT7의 결과입니다.

예상하는 band size가 TA에서는 1800bp와 2700bp였기때문에 얼추 맞다고 생각했고, pGBKT7도 거즘 7900bp가 되었기 때문에 맞다고 생각하여 이 동일한 용액을 gel elution을 진행하였습니다.

저한테는 1800bp의 저 insert DNA가 필요했기때문에 밑 부분만을 잘 도려내어 시도했는데 

이때 intron사의 megaquick-spin plus purification kit를 사용하였습니다.

이렇게 purification을 진행한 후 band size를 위해 다시 gel을 내렸더니

upload_image

갑자기 이런식의 band size가 뜨게 됩니다. 1800bp에 가있어야한 band가 1000bp근처에 가있고 8000bp근처에 있던 pGBKT7은 5000bp근처에 가있게 됩니다.

이게 무엇을 의미하는지 잘 모르겠어서 동일 실험을 3번째 반복중인데 계속 같은 결과가 나오고 있습니다. 

조언 좀 부탁드립니다 ㅜㅜ

긴글 읽어주셔서 감사합니다.

#band shift
 
#gel elution
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리AstV  |  2019.07.27   
음..첫 사진 2,3,4 라인 시료를 정제해서 두번째 사진 2,3,4처럼 나온건가요?
알마이어  |  2019.07.27   
네 2,3라인 은 밑에 band를 gel elution 하고 4라인은 밴드가 하나라 그냥 purification했습니다. 2번째사진 5라인은 제가 TA vector에 insert로 집어넣기전 pcr product을 control로 쓴 band입니다
대왕개구리안재진  |  2019.07.29   

2번째 사진에 PCR 밴드와 같은 부위에 얇은 밴드가 보이는데...
2/3번에 얇은 밴드가 보입니다.

내부 enzyme site는 없나요?

DNA를 자르고 Heat inactivation을 진행하고 Gel 걸고 elution을 해보세요...

 

분명 PCR 밴드와 사이즈 크기가 나니... 내부 enzyme site 문제라도 분명 이상하긴 합니다...
shift보다는 내부에서 짤리는 것 아닌가 합니다...

알마이어  |  08.05 01:11  

저와 같은 결과를 보고계실수 있는 분들을 위해서 해결과정을 쓰자면,

계속해서 같은 방식으로 gel extraction했을때도 동일한 결과가 나왔었는데

제가 전기영동할때 loading 용액을 만드는 비율이 

DNA 0.5ul 

DW 4.5 ul 

6x loading dye 1ul

이렇게 였습니다.

제가 혹시나 DW로 elution했던 DNA 용액의 상태가 좀 이상할까 싶어서 DW 대신 TE buffer로 dilution했더니,

그제서야 밴드가 정확한 위치에 나오더군요

혹시 같은 경험을 하고 계시는 분들이라면 DNA 용액 자체를 좀 안정화 시켜서 젤을 내려보실 필요도 있을거 같습니다.

답변하기
할인행사 광고 검색광고
하나과학 하나과학
Socorex 2020 BIG SALE event - Socorex Acura manual micropipe.. (1.31까지)
케이비티 케이비티
Mixer, Dry Bath, Heating Block, Thermo Shaker, Shaking Incub.. (10.22까지)
다온비에스 다온비에스
내 소중한 세포를 위해 안심하고 맡길 수 있는 WOLF Cell Sorter를 경험하세요! (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
무료 샘플로 명품 NEB의 DNA/RNA Purifucation 성능을 경험하세요. / NEBulider®.. (9.29까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
[에펜도르프코리아] Eppendorf 2020 하반기 프로모션 행사 : 실험실 필수품 피펫,원심분리기,PCR.. (12.31까지)
인성크로마텍 인성크로마텍
Phenotype MicroArray™ - Live Cell 에너지 대사 & 감수성 프로파일링 (10.31까지)
브래디 브래디
[브래디] 초저온라벨 등 실험실용 라벨링 솔루션 (COVID19 안전사인 등) (10.30까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
TECAN 한국대리점 20주년 기념 Microplate Reader & Washer 할인이 쏟아진다! (12.31까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
2/6  좌우
924,000
22,7006,900
139,000132,100
230,000
79,50075,600
238,70071,700
242,40072,800
793,400238,100
136,000129,200
245,20073,600
136,000
739,000702,100
80,40024,200
388,500116,600
555,000
201,30060,400
50,00015,000
887,200266,200
47,20044,900
143,800136,700
158,40047,600
309,000
379,000
246,60074,000
최근등록   더보기 >
Agrobacterium 배양 액체 배지   09.23
혹시 식이 효율에 아시는 분 계신가요??   09.22
동물혈액을 구해야합니다.   09.22
델타 CT값이 높으면   09.22
cloning이 완료된 단백질이 정제가 되지 않고 있는데, 그 이유가 궁금합니다.   09.22
알코올 발효와 분해에 관하여 궁금한 점이 있습니다.   09.22
UPLC-Q-TOF-MS 에서 positive mode와 negetive mode의 의미?...   09.22
뇌졸중 모델 관련해서 질문드립니다.   09.22
pcr을 하지 않고 직접 추출해 염색한 DNA를 로딩했는데 buffer 위로 떠오릅니다ㅠㅠ   09.22
PCR negative 결과   09.22
(주)비아이코퍼레이션
실험관련연재
박은총 연재중후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
Mr.S 연재중의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재중실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
이제욱 연재중생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고