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질문 IHC frozen section 조직에 구멍이 납니다.
알woorame(대학원생)  |  07.23 21:54

고수님들 ㅠㅠㅠ 도와주세요!!!!!!

 

안녕하세요, 저는 IHC를 하기위해 section 연습을 하고있는 대학원생입니다.

Frozen section으로 진행을 하고있는데 section이 잘 되었는지 현미경으로 확인하면 계속해서 아래와 같이 조직에 구멍이 나있습니다.

upload_image

조직은 Muscle이며, mold에 심은 후 -80도에 보관했다가 Cyosection전 -20도에서 10분 정도 온도적응 시킨 후 section을 진행하고 있습니다.

처음에는 section시 온도 문제인걸로 판단하여 -17,-18,-19,-20도씨 모두 조건 검토하였는데 그래도 결과는 똑같았습니다.

또한 현미경 촬영 전 충분히 말린 후 촬영했습니다.

혹시 아래 사항이 문제인지 싶어 기재해보았습니다.

1. 조직을 Section 후 slide glass에 붙이는 과정에서 문제가 될 만한 것은 Antiroll plate를 사용하지 않고 붙으로만 한다는 점

2. 해부 후 mold에 조직을 심을 때 isopentane이 아닌 드라이아이스에서 얼린 점  

3. 박절 후 건조될 때 까지 20분정도 두었다가 드라이아이스에 보관하여 이동하였는데 혹시 건조 시간에 문제가 있는 걸까요?

위  사항이 문제가 되었을까요? 아니면 부족한 제 기술탓일까요..ㅠㅠ

동일한 경험 해보신 분들 ㅜㅜㅜ제발 답변 부탁드립니다ㅠㅠㅠ

#IHC
 
#section
 
#구멍
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

결론만 말씀드리면 frozen 과정에서 샘플에 남아있던 물이 얼면서 팽창하여 조직에 구멍이 생긴겁니다.

 

저와 방법이 달라 참고삼아 말씀드리면 구멍을 적게 하기 위해서는 샘플 고정 작업 이후 15% sucrose 에 담궈 냉장보관한 뒤 샘플이 가라앉는 것을 보고 동일하게 30% sucrose 에 담궈 down 시킵니다. 그리고 mold 에 넣어 section 떠보시면 조직에 구멍이 덜 생길 것입니다.

1. 붓 말씀 이신거겠죠? 붓은 문제 없습니다.

2. 드라이아이스에 얼리신다고 하셨는데 저는 mold 바닥에 철판을 두어 deep freezer 에서 2시간 얼린 뒤 밀봉 포장하여 -20 도씨에 보관합니다 (샘플의 건조 방지)

3. 저는 frozen section 이후 따로 건조 과정없이 4 도씨에 보관하였다가 사용합니다.

 

도움이 되면 좋겠네요.

기웃  |  07.24 11:21   

답변해주셔서 감사합니다.

보통 해부 후 4% paraformaldehyde로 고정 후 30% sucrose에서 dehydration 시키고 나서 deep freezer에 보관하는 것 같은데

저희는 이과정을 생략하고 조직 채취후 바로 mold에 심어 OCT compound를 도포했습니다. 혹시 위와같은 작업 (4% paraformaldehyde, 30% sucrose)을 생략해서 조직에 구멍이 났을 가능성이 커보입니다.

실험실마다 프로토콜이 다르겠지만 제가 진행한 방식대로 하는 분들도 계시던데 전처리 과정이 꼭 필요한걸까요?

알woorame  |  07.24 17:36  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Frozen section 을 쓰는 이유를 생각해보면 쉽습니다.

애초에 frozen section 은 빠른 시간에 염색하여 조직을 관찰하기 위한 목적으로 사용합니다. 그래서 많은병원 병리과에서 수술 중 의심되는 조직이 cancer 인지 확인하기 위해 많이들 사용하죠.

그게 아니고 논문용 실험으로 quality 를 목적으로 하는거라면 sucrose down 으로 dehydration 작업을 진행하면 되겠지만

그럴꺼면 paraffin section 이 훨씬 더 좋겠죠?

 

연구자의 목적에 맞게끔 paraffin 이나 frozen 이나 선택해서 하시면 될 것 같습니다.

기웃  |  07.24 17:54   
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