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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 western blotting 결과인데 확인 부탁드립니다.
알마이크로디(대학생)  |  07.19 19:38
첨부파일 파일첨부: 그림1.png (1,011 KB)
이미지 첨부파일

protein expression 확인하기 위해 Western blotting을 하였습니다. 1차 antibody는 rabbit을 사용하였고, 2차 antibody는 Rabbit-HRP 를 사용하였고 ibright 를 사용하여 찍은 결과입니다. 첫번째 ladder는 maker이고  마지막은 Negative입니다. 그리고 나머지는 다 sample입니다. 각각 다른 sample이긴 하나.. 밴드가 다 같은 위치에 뜹니다. 1차 antibody는 3번째 -20도씨에 보관해놨었고 4도씨에서  overnight시켰습니다. 3번째 재사용중이고 5% skim milk +PBST1% 에 넣고 사용하였습니다. 문제는 이러한 밴드가 계속 보이는 것이 아니라 종종 나타나는데  wild 부분과계속 같이 뜨고.. antibody문제인지.. antibody는 histaq antibody입니다. 심란하네요... ㅠ western blotting 에 대해 잘 아시는 분 답변부탁드립니다.. 왜 밴드가 이런현상을 띄는지.. 무엇이 문제인지.. 발현이 된건지 판단하기가 어렵습니다. 

#western blotting
 
#protein expression
 
#antibody
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무엇이 잘못된 것인지 확실히는 모르겠지만, 현재 blot 상의 negative control에서 band가 보이는 것으로 보아, 같은 사이즈의 sample band가 target protein인지 아닌지 판단할 수 없을 것 같습니다.

negative control과 marker lane에서 동일한 size band가 나온 것으로 보아, antibody quality가 좋지 않아서 target 이외의 protein을 잡는 것일 가능성이 높습니다.

background issue에 대해서는 잘 정리된 페이지가 있어서 붙입니다.

https://www.ibric.org/myboard/print.php?Board=exp_qna&id=568056

가능하다면 antibody를 stripping하여 새로 antibody를 만들어 붙이는 것이 하나의 방법이 될 수 있을 것 같습니다.

혹은 다시 웨스턴 해서 새 antibody를 붙이시는 것이 깔끔할 것 같습니다.

2차 안티바디는 재활용 안 하시는지요?

올챙이Molang  |  07.19 21:03  

답변 감사드립니다. 2차 안티바디는 재사용하지 않습니다.. 다시 western 진행해보겠습니다.. 올려주신 링크는 도움이 많이 될것같습니다!! 감사합니당^-^

알마이크로디  |  07.20 11:08  
스킴밀크에 안티바디를 타서 쓰신다면 얼리지 마시고 sodium azide 넣고 냉장고에 보관해서 쓰시는 방법도 고려해보세요. 제 지인이 그렇게 하더라구요.
혹은 스킴밀크 대신 bsa에 희석해서 써보시는 것도 하나의 방법이 될 수 있습니다.
아니면 다른 연구실에서 다른 안티바디를 빌려서 사용해보세요. 안티바디 문제인지 아닌지를 판단할 수 있습니다.
올챙이Molang  |  07.20 13:53  

1. 발현 host가 어떤 종인가요? E.coli 인가요? 대장균에서 발현하고 웨스턴으로 쉽게 학인이 안될 정도면 발현 안되었을 확률이 높습니다.

안나오다 보니 샘플량을 높이고 그게 옆으로 넘어가서 M N에서도 밴드가 나온게 아닐까 합니다.

2. expose 시간이 얼마나 되나요? 밴드가 안나와서 계속 expose 시킨것은 아닌지요? 랩에 정제된 다른 6x tag 단백질이 있다면 그것을 미량 걸어 PC 밴드로 사용해보세요... 그게 안나온다면 항체나 웨스턴법에 문제가 될수 있습니다. 그건 나오고 내것만 이상하다면 내 샘플 문제 일수 있습니다.

3. 저는 SCBT 항체를 이용하는데 6x tag 항체는 1:10000 으로도 충분히 나옵니다. 실험이 안될때 계속해서 저장된 항체를 사용하지 마시고 프레쉬하게 사용해보세요

 

결국 PC가 있어야 문제를 찾아가는게 쉽습니다. 적당한 PC 샘플을 어떤것을 사용할지를 고민해보세요

금개구리안재진  |  07.22 10:32  
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