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레벨2
Molang
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19.07.19 21:03
무엇이 잘못된 것인지 확실히는 모르겠지만, 현재 blot 상의 negative control에서 band가 보이는 것으로 보아, 같은 사이즈의 sample band가 target protein인지 아닌지 판단할 수 없을 것 같습니다.
negative control과 marker lane에서 동일한 size band가 나온 것으로 보아, antibody quality가 좋지 않아서 target 이외의 protein을 잡는 것일 가능성이 높습니다.
background issue에 대해서는 잘 정리된 페이지가 있어서 붙입니다.
https://www.ibric.org/myboard/print.php?Board=exp_qna&id=568056
가능하다면 antibody를 stripping하여 새로 antibody를 만들어 붙이는 것이 하나의 방법이 될 수 있을 것 같습니다.
혹은 다시 웨스턴 해서 새 antibody를 붙이시는 것이 깔끔할 것 같습니다.
2차 안티바디는 재활용 안 하시는지요?
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레벨1
마이크로디
(대학생)
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19.07.20 11:08
답변 감사드립니다. 2차 안티바디는 재사용하지 않습니다.. 다시 western 진행해보겠습니다.. 올려주신 링크는 도움이 많이 될것같습니다!! 감사합니당^-^
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레벨2
Molang
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19.07.20 13:53
스킴밀크에 안티바디를 타서 쓰신다면 얼리지 마시고 sodium azide 넣고 냉장고에 보관해서 쓰시는 방법도 고려해보세요. 제 지인이 그렇게 하더라구요.
혹은 스킴밀크 대신 bsa에 희석해서 써보시는 것도 하나의 방법이 될 수 있습니다.
아니면 다른 연구실에서 다른 안티바디를 빌려서 사용해보세요. 안티바디 문제인지 아닌지를 판단할 수 있습니다.
1. 발현 host가 어떤 종인가요? E.coli 인가요? 대장균에서 발현하고 웨스턴으로 쉽게 학인이 안될 정도면 발현 안되었을 확률이 높습니다.
안나오다 보니 샘플량을 높이고 그게 옆으로 넘어가서 M N에서도 밴드가 나온게 아닐까 합니다.
2. expose 시간이 얼마나 되나요? 밴드가 안나와서 계속 expose 시킨것은 아닌지요? 랩에 정제된 다른 6x tag 단백질이 있다면 그것을 미량 걸어 PC 밴드로 사용해보세요... 그게 안나온다면 항체나 웨스턴법에 문제가 될수 있습니다. 그건 나오고 내것만 이상하다면 내 샘플 문제 일수 있습니다.
3. 저는 SCBT 항체를 이용하는데 6x tag 항체는 1:10000 으로도 충분히 나옵니다. 실험이 안될때 계속해서 저장된 항체를 사용하지 마시고 프레쉬하게 사용해보세요
결국 PC가 있어야 문제를 찾아가는게 쉽습니다. 적당한 PC 샘플을 어떤것을 사용할지를 고민해보세요