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 전체 > Cell Biology > Cell Cycle
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질문 FACS로 Cell cycle 실험할 때 y축 숫자가 달라요
알YLEE25(대학원생)  |  07.19 15:03

 

안녕하세요, 존경하는 연구자님들

제가 FACS로 cell cycle 확인하는 실험을 구글링해서 배워서 

요즘 열심히 찍고 있는데요,

 

cell과 어떤 유전자를 ko한 cell에 약물을 처리한 후

subG1을 확인하려고 하는데,

 

y축은 cell 수를 나타내는 거잖아요~

Ctrl cell에 약물 처리 안했을 때는 peak가 뜨는 숫자가 꽤 큰데

약물을 처리하거나 ko cell에 약물을 처리할 때는 peak 숫자가 작아지거든요~

 

근데 논문들 보니까 왼쪽 숫자가 고정해놓은 것처럼 전부다 숫자가 동일하던데 어떻게 해야하는 것인가요?

 

잘 아시는 분이 있다면 설명해주시면 감사드리겠습니다. (^^)(_ _)

##FACS
 
##CELL CYCLE
 
##SUBG1
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
FSC와 count의 plot말씀하시는 것 같은데요.

옵션값에서 count 한계치를 설정하시면 됩니다. 예를들어
2만개 3만개 이렇게요. 즉, 흘려주는 시간말고 찍히는 숫자의 한계치를 잡아서 고정시키면 됩니다.


그렇게 하면 약물처리 샘플은 초당 찍히는 count 수는 적고 천천히 분석되도 peak크기는 어느정도 유사하게 가실 수 있을겁니다.
개구리AstV  |  07.19 15:09  

 

오!! 그렇군요. 그럼 facs 찍을 때 고정을 할 수 있는건가요?

annexin V/ PI staining해서 apoptosis 볼 때는 total counting 갯수를 10,000으로 고정해두고 찍기는 합니다!

알YLEE25  |  07.19 16:40  
첨부파일 파일첨부: 1563591783266.jpg (193 KB)
이미지 첨부파일
Total count를 10000으로 이미 고정하셨다면, 혹시 분석 런타임도 고정하시나요? 1분 2분 막 이렇게요. 그렇다면 1만개 찍히기 전에 분석 런타임 셋팅해놓은 시간에 먼저 도달할 수도 있고요.

그게 아니라면 apoptosis를 보신다는거 같던데 cell이 터지면 작은 부스러기가 많이 나올거 같거든요? 이걸 detector가 다 감지할텐데 그러면 원하는 cell만이 아니라 부스러기까지 카운트에 잡히거든요. 그럼 cell size부분에는 부스러기 때문에 적게 찍히는 거에요. 이 거의 해결법으로는 FSC threshold를 높여서 정상cell 크기 부분만 카운트되도록 조절해보세요.

아니면 카운트, 분석시간 다 해제하고 cell size부분만 잡아서 gating된 부분의 카운트수를 분석할때 실시간으로 확인이 가능하니까 1만개쯤 될때 끉는 메뉴얼적인 방법도 있어요

왠지 약물처리해서 cell 터져서, 정상세포 크기의 cell수가 줄어서 피크가 낮은거 같은데..아마 후자일꺼 같네요.
안그래도 제가 요즘 미세조류 cell lysis해서 찍어보고 있거든요ㅎㅎ

제가 찍는건 그림처럼 나와요. 걷는동안 써서 ㅋㅋ
개구리AstV  |  07.20 11:31  
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