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 전체 > Microbiology > Bacteria
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질문 Mucoid type colony(?)를 형성하는 고초균의 생균수 측정 관련 조언 부탁드립니다.
올챙이뚠뚠이(과기인)  |  07.19 13:30

안녕하세요?

날이 더운데 잘 이겨내고 계신지요.

 

지난번 고초균 진탕배양 시 뭉침현상이 일어났다고 질문을 올렸었는데,

답변해주신대로 오염이 맞아 조언해주신대로 했더니 문제가 잘 해결되었습니다. 다시한번 감사합니다.

 

이번엔 생균수 측정에서 어려움이 있습니다.

 

PCA plate에 균을 깔면 투명한 점액질을 형성하며 동그란 콜로니를 형성하는 고초균을 키우고 있습니다.

 

생균수 측정으로 각 성분별 최적 배지를 제조하고 있는와중에

 

매번 할때마다 카운팅 되는 생균수가 달라져 (매우 많이) 조언을 얻고자 합니다.

혹시 제가 하는 방식에 문제점이 있는지 알려주실 수 있을까요?

회사 선임분은 제 실험 방식에는 문제가 없는 것 같은데 균수가 들쭉날쭉하니 의아하다고 하시고, 저는 자신감이 점점 사라지네요.. 그래도 나름 석사도 하고 했는데 생균수 카운팅이 이렇게 안된 적은 이번이 처음입니다,,,

 

 

500ml flask에 200ml 배지 제조하여 넣고, 멸균합니다.

이후 시드 1% 접종하여 37℃, 105rpm, 24시간 배양합니다.

BK로 TSB 배지 사용하였으며 나머지는 실험군으로 실험을 진행하고 있습니다. 1주일에 동일 조건에서 2번씩 생균수 측정을 하며 3반복 진행합니다..

 

24시간 배양 후 시판되는 9ml 생리식염수가 든 통에 잘 흔든 1ml 균주 접종 후 볼텍싱 (약 5초), 손으로 10회정도 흔들어 준 후 차례로 희석합니다.

 

파이펫팅의 경우

팁을 액체의 중간까지 찔러서 희석액을 따고, 다음 희석배수에 넣을때는 끝부분만 대서 조심스럽게 분주해 준 후 몇번 파이펫팅 해주는 식으로 진행했습니다.

 

사용한 plate는 PCA (시판되는 완제품배지)이며 사용할때 냉장고에서 꺼내서 바로 사용하였습니다. (말리지 않고 사용했습니다.)

 

도말 전 각 시료 볼텍싱 한 후 100ul씩 따서 plate에 도말하였습니다.

 

이 후 plate를 배양기에 넣고 24시간 뒤에 생균수를 측정합니다.

 

 

 

그런데...

매번 할때마다 균수가 다르게 나오고,

(TSB의 경우 7승 중반, 어쩔땐 8승 초반, 어쩔땐 5승 이하)

TSB를 제외한 나머지 배지도 비슷한 양상으로 다르게 나옵니다....

 

 

분명 배지는 배양 전과 비교하여 보얗게 잘 자란 것 같이 보이고 현미경 검경을 해도 분명 균이 있고, OD값도 높게 나오는데...

생균수 측정만 하면 5승 이하로 나올때가 많습니다.

 

뭐가 문제인지 도통 모르겠어서 

시판되는 거 사용하던 식염수 말고, 직접 0.85% NaCl 용액 만들어서 제조한 후 1.5ml ep 튜브에도 serial dilution해보고,, 

 

지금 생균수 측정분에 신뢰성을 높이기 위한 실험만 4주째 진행되는데 

할때마다 균수가 들쭉날쭉이라 자괴감이 느껴지네요..

 

 

제가 생각하는 문제점으로 

 

1. 시판 한천배지를 말리지 않고 그대로 사용한 것

2. 볼텍싱 시간을 10초 이하로 한 것 (균주가 점액과 같은 성상이기 때문에 충분히 잘 풀어주지 않아 균이 제대로 희석되지 않았다?)

 

두가지밖에 모르겠습니다..

일단 상기 두가지 요인을 변경하여 오늘 한번 더 테스트 진행해 볼 예정인데,

이 외에 제 실험법에 오류가 있는 부분이 있는지, 혹시 저와 비슷한 경험이 있으셨다면 어떻게 해결하셨는지 조언해주시면 감사하겠습니다..

 

ps. http://textbookofbacteriology.net/Bacillus_2.html

상기 링크에 보이는 사진이 제가 키우는 고초균과 동일한 성상입니다.

혹시 생균수 테스트에 문제가 있는 것이 균의 끈적이는(?) 성상과 연관이 있을런지요?

 

조언해주시면 대단히 감사하겠습니다.

 

#고초균
 
#생균수
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

점성은 액체 배양에서 생기지 않고 plate 배양에서만 생깁니다.

B. amyloliquefaciencs 계열 같아 보입니다.

생균수가 들쭉날쭉하는 것은 대부분 희석문제에서 기인할 겁니다.

혹시 희석 단계를 몇 단계로 하나요? 

대왕개구리SPEED  |  07.19 14:18  

안녕하세요!!

 

매번 빠른답변에 감사드립니다!!

 

저는 예상 기대 균수가 8승 수준이라 10^5, 10^6배 희석액을 깔았습니다.

(과거 자사에서 수행된 해당 균주 데이터가 TSB 기준 flask에서 8승, 퍼멘터 9승이었다고 들었습니다)

 

하단에 제가 금주에 실험한 결과를 대충 보여드리겠습니다..

난리가 났죠? ㅎㅎ.. 빈칸은 아예 콜로니가 안뜬겁니다..

 

 

  초기접종량 1% / 0.5L 플라스크, 200ml    
              시험일자: 2019-07-12~19
7월 17일 결과
(10ml)
200/500ml 반복수 대조구 실험구
TSB        
5승 1   32      
2          
3          
6승 1 20        
2          
3          
7월 18일 결과
(21hr, 1ml)
200/500ml 반복수 대조구 실험구
TSB        
5승 1     208    
2     224    
3          
6승 1   38 21 18  
2   54 26 12  
3   24 39    
7월 18일 결과
(24hr, 1ml)
200/500ml 반복수 대조구 실험구
TSB        
5승 1     150 128  
2          
3          
6승 1   38 17 17  
2          
3          
7월 18일 결과 200/500ml 반복수 대조구 실험구
TSB        
5승 1 117 78 96 33 64
2 112 70 91 33 52
3 78 71     60
6승 1 12 8 16 1 10
2 11 2 12 7 8
3 12 7 20 1 17

 

올챙이뚠뚠이  |  07.19 14:47  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

희석 단계를 몇 단계로 하는지는 10^5, 10^6 희석을 어떤 단계로 하는지를

물어본 것입니다, 

대왕개구리SPEED  |  07.19 14:50  

 

아! 죄송합니다. 제가 답변 파악을 못했네요..

갑자기 회의에 들어가서 대답이 늦었습니다.

 

 

시판되는 9ml 생리식염수 들어있는 작은 통에

배양액 1ml를 담아 볼텍싱(5초) 해주었습니다. (10배 희석액)

 

상기 10배 희석액을 볼텍싱(5초) 한 후 손으로 흔들어준다음

1ml을 따서 다시 다음 9ml 생리식염수통에 넣고 상기와 같은 방법으로 연속적으로 희석하여 5승, 6승 희석액을 만들었습니다.

 

이 단계에서 문제가 발생했을까요?

지금 실험 막 들어가려고 하는데 이번엔 볼텍싱을 30초 이상 강하게 해보려고 하고 있습니다.

 

올챙이뚠뚠이  |  07.19 16:00  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

먼저 microtube를 사용하며 멸균수와 식염수 2종을 사용하여 비교를

한번해보세요.

그리고 지금처럼 10배 희석을 단계로 해보고 10^2배 희석을 해서 비교도

해보세요.

1. 10. 10^2. 10^3, 10^4, 10^5, 10^6

2. 10^2, 10^4, 10^5, 10^6

희석 단계를 줄여서 1, 2 값이 비슷하게 나오는지 비교해 보세요.

 

대왕개구리SPEED  |  07.19 16:41  

SPEED님 매번 조언에 너무나 감사드립니다.

 

말씀해주신 대로 비교해보고 문제점을 다시한번 파악해보도록 하겠습니다.

 

비도 오는데 분위기 있는 금요일 보내시고,

주말도 행복하게 보내시기 바랍니다.

 

다시한번 정말 감사합니다.

올챙이뚠뚠이  |  07.19 17:27  
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