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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 Cloning 문제로 질문드립니다.
알짧은시간동안(대학생)  |  07.19 11:34
현재 2개의 다른 vector를 restriction enzyme으로 잘라 ligation 하려는 석사생입니다.
각 vector에 Afl2, sca1 을 쳐서 ligation 후 transformation을 진행했지만 colony가 나오지 않습니다.
Ligation 하기 전에 elution한 insert, vector 모두 size를 확인하였고, 1:6 ratio로 RT 1h ligation 후 DH5a에 transformation 하였습니다.
Ligation이나 transformation, cp cell은 다른 gene들을 cloning할 때 잘되었기에 문제가 없다고 생각되어집니다.
Subcloning시 plasmid 크기가 9kb인데 혹시 DH5a에 들어가기에는 무리가 있는 size인가요? 어떤 문제점이 있을지 감이 오질 않습니다...
제품은 모두 NEB 제품을 사용하고 있습니다.
#Clonong
 
#Subcloning
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
그람양성균 락토바실러스 플란타럼에 약 6kb가까운거 넣어봤을때 콜로니 50개?정도 확인한적이 있는데.. e. coli는 비교적 더 잘 들어갈테니, 문제라면 transformation efficiency가 좋아야하겠네요.
개구리AstV  |  07.19 12:57  

colony가 안나오는게 positive selection이 안되는 겁니까 아예 colony가 안나오는

겁니까?

질문 내용만으로는 왜 실험이 안되는지 파악하기 힘듭니다. 

DH5a에 50Kb 이상의 유전자도 잘 들어갑니다.

대왕개구리SPEED  |  07.19 14:12  
벡터 각각이 수kb라면 ligation과 transformation 효율 모두 떨어질 가능성이 크다.
크기가 비슷하다면 몰비로 1:1 비율로 하여 ligation 온도를 16도로 낮춰서 O/N 하기를 추천한다. 길면 ligation 하기가 힘든데 온도가 높으면 더 힘들기 때문이다. 천천히 움직이면서 두 사람이 손을 마주 잡는 것과 뛰면서 마주 잡는 걸 생각해 보면 온도가 왜 중요한 지 이해가 간다

일반적으로 크기가 3kb만 넘어가도 효율이 많이 떨어진다.
Transformation 도 가능하면 electroporation 을 추천한다.
9kb 정도면 효율이 많이 떨어진다.
크기에 따라 비례적으로 효율이 떨어지는 게 아니라 어느 정도를 넘어서면 얻기가 힘들어질수도 있다.
개구리DTer  |  07.19 19:38  

세 분 모두 답변 감사드립니다.

구체적인 상황을 설명하자면 이렇습니다.

현재 실험은 기존 PCR로 합성한 insert(3Kb)와 vector(6kb)를 ligation하여 나온colony를 sequencing으로 확인하니, 일부 200bp deletion되어있는 걸 발견하였습니다. 해서 이를 sequence가 정확한 vector에서 위의 제한효소로 잘라내어 붙여넣을려고 합니다. 하지만 insert와 vector를 확인 후 ligation하고, transformation 했을 시 colony가 나오질 않았습니다.

AstV님

 transformation efficiency는 PCR한 Vector를 transformation 했을 때 30개 정도의 colony가 나왔었기에, 좋다고 할 순 없지만 나쁘다고 생각되지는 않습니다. ligation한 mix의 양을 늘려서 efficiency를 높여보겠습니다.

SPEED님

 PCR한 Vector를 positive control로 가정시, 현재 문제점은 restriction enzyme을 친 insert와 vector에서 어떤 문제가 있을 것이라고 생각되어집니다. 하지만 size가 확인된 insert와 vector에서 ligation이 문제인지 어떤 것이 문제인지 모르겠습니다. 다만 공통분모로 묶기는 좀 그렇지만, 여태까지 restriction enzyme을 치고 ligation 후 transformation시, 원하는 size의 subcloning이 안됬다는 공통점이 있습니다.

Dter님

알려주신 ligation 방법은 참고하여 알아본 뒤 실험에 반영하겠습니다. 알려주셔서 감사합니다. 

 

 

 

알짧은시간동안  |  07.19 22:50  

vector를 제한효소로 잘라 준비하는것이 아니라 PCR로 만드는 이유가 있나요?

vector PCR은 어떤종류의 taq을 사용하나요?

200bp정도 사라지는 것이 vector쪽 인가요?

vector와 insert를 몇 ng정도 사용하나요?

colony가 안나오면 말단이 안맞든지 ligation 반응이 일어나지 않았든지 하는데

ligation 후 전기영동으로 ligation mixture를 확안하고 나서 TF 하나요?

대왕개구리SPEED  |  07.19 23:16  
transformation efficiency올리는 방법으로 논문을 보면,

컴셀만드는 조성
컴셀만드는 시기(이른 로그phase)
큐벳 전극간 distance
전압 저항 조건

도 영향있다고 하네요. 대학원때 그람 양성균 작업해보다보니ㅎㅎ

주변 사람들 말로는 실험 장비 노후화 등등의 이슈로 실험실마다 최적 조건을 잡는 일도 가끔씩 해봐도 좋다고 하니 믿져야 본전식으로 몇 가지 조건으로 랩세미나 끝나고 기분좋으실때 비교해보세요. 생각보다 조건별로 뜨는 콜로니 수가 상이하게 다르실겁니다.
개구리AstV  |  07.20 08:02  

SPEED님

- Insert를 PCR로 만든건 restriction enzyme으로 잘라 붙이는게 잘 안되서 차선책으로 선택한 방법이였습니다. PCR을 하기 전 원래 restriction enzyme으로 자르려 하였는데, 한 enzyme이 망가진것을 뒤늦게 확인하였고, enzyme 주문하는 시간동안에 시도해본 방법입니다.

- PCR은 NEB phusion polymersase를 사용하였습니다.

- 200bp정도 사라진 것은 PCR로 만든 insert입니다.

- vector(8kb)는 100ng, insert(1kb)는 80ng 사용하였습니다. 

- 따로 ligation 후 전기영동을 걸어서 확인하지 않았습니다. 저도 이 단계는 조금 의심이 갑니다...따로 해본적은 없으나 ligation 되어진 plasmid가 band로 보일만큼 많이 ligation이 되나요?

AstV님

 네 transformation 조건은 더 적합한 것이 있는지 선출하여 비교해보겠습니다. 감사합니다.

알짧은시간동안  |  07.20 22:56  
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