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질문 cAMP측정 실험 진행중인데 도움부탁드립니다.
알yuri55(대학원생)  | 2019.07.19 10:23

안녕하세요

다름아니라 저는 INS-1 cell과 RIN-m5F cell을 이용하여 GLP-1 약물을 처리한 후 cell lysis를 한 뒤 cAMP assay kit를 통해 cAMP발현이 농도에 따라 증가되는 실험을 진행하고 있습니다.

현재 사용하고 있는 kit는 R&D사의 KGE002B인데요

assay는 competitive assay로 cAMP농도가 높을 수록 OD값은 낮게 측정되는 원리입니다 여기서 문제가 되는것은...

실험은 아래와 같이 진행되고 있으며 GLP-1 농도에 따라 cAMP가 증가되는 현상이 보이질 않고 있습니다. (즉 농도차이 없이 OD값이 다 동일하게 확인됨)

이와 관련하여 경험이 있으신 분들에 조언 부탁드립니다

왜 농도에 따라 처리하였는데 결과에 차이가 나지 않을까요?

혹시 위 cell을 이용하여 cAMP를 확인하여 sigmoidal curve를 확인하셧거나 방법이 있으시다면 조언 부탁드립니다. (cell은 꼭 저 cell들로 진행되어야 합니다)

야래는 제가 실험한 방법을 정리해보았습니다.

1) RIN-m5F/INS-1 cell을 투명96well plate에 1x10^5 cells/100uL로 seeding 후 24시간 binding 
(cell이 96well 안에서 confluency 90% 이상을 확인함) 
2) 다음날 glucose without(Gibco) and serum free media로 2시간 starvation 진행함 
3) 이후 용액을 제거하고 PBS 100uL/well로 wash  
4) GLP-1을 1x PBS with 500uM IBMX with Ro01724 100uM 희석버퍼로 1000nM부터 1/10씩 희석하여 
100uL/well로 분주 후 RT에서 20분간 반응시킨 후 제거함
5) Cell lysis buffer 5x를 DW로 1x를 희석한 후 200uL/well로 분주하고 10분정도 기다린다.
6) cell lysis 전에 Goat anti-mouse antibody가 coating된 well에 primary antibody (mouse monoclonal cAMP Ab)를 50uL/well 분주 후 1시간동안 반응시키고 3회 washing 한다.
7) 50uL/well의 cAMP conjugate(cAMP-HRP)를 모든 well에 분주 한 후 100uL/well로 sample을 분주하고 NSB와 blank는 calibrator RD5-55를 분주한다.
8) PBST로 washing 한후 TMB를 분주하여 발색을 확인한다.

#cAMP
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