[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
라이카써머캠프
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Cell Biology > etc.
조회 741  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 cAMP측정 실험 진행중인데 도움부탁드립니다.
알yuri55(대학원생)  | 2019.07.19 10:23

안녕하세요

다름아니라 저는 INS-1 cell과 RIN-m5F cell을 이용하여 GLP-1 약물을 처리한 후 cell lysis를 한 뒤 cAMP assay kit를 통해 cAMP발현이 농도에 따라 증가되는 실험을 진행하고 있습니다.

현재 사용하고 있는 kit는 R&D사의 KGE002B인데요

assay는 competitive assay로 cAMP농도가 높을 수록 OD값은 낮게 측정되는 원리입니다 여기서 문제가 되는것은...

실험은 아래와 같이 진행되고 있으며 GLP-1 농도에 따라 cAMP가 증가되는 현상이 보이질 않고 있습니다. (즉 농도차이 없이 OD값이 다 동일하게 확인됨)

이와 관련하여 경험이 있으신 분들에 조언 부탁드립니다

왜 농도에 따라 처리하였는데 결과에 차이가 나지 않을까요?

혹시 위 cell을 이용하여 cAMP를 확인하여 sigmoidal curve를 확인하셧거나 방법이 있으시다면 조언 부탁드립니다. (cell은 꼭 저 cell들로 진행되어야 합니다)

야래는 제가 실험한 방법을 정리해보았습니다.

1) RIN-m5F/INS-1 cell을 투명96well plate에 1x10^5 cells/100uL로 seeding 후 24시간 binding 
(cell이 96well 안에서 confluency 90% 이상을 확인함) 
2) 다음날 glucose without(Gibco) and serum free media로 2시간 starvation 진행함 
3) 이후 용액을 제거하고 PBS 100uL/well로 wash  
4) GLP-1을 1x PBS with 500uM IBMX with Ro01724 100uM 희석버퍼로 1000nM부터 1/10씩 희석하여 
100uL/well로 분주 후 RT에서 20분간 반응시킨 후 제거함
5) Cell lysis buffer 5x를 DW로 1x를 희석한 후 200uL/well로 분주하고 10분정도 기다린다.
6) cell lysis 전에 Goat anti-mouse antibody가 coating된 well에 primary antibody (mouse monoclonal cAMP Ab)를 50uL/well 분주 후 1시간동안 반응시키고 3회 washing 한다.
7) 50uL/well의 cAMP conjugate(cAMP-HRP)를 모든 well에 분주 한 후 100uL/well로 sample을 분주하고 NSB와 blank는 calibrator RD5-55를 분주한다.
8) PBST로 washing 한후 TMB를 분주하여 발색을 확인한다.

#cAMP
답변하기
첫 댓글을 달아주세요.첫 답변을 달아주세요.
답변하기
할인행사 광고 검색광고
다온비에스 다온비에스
[DNAGenotek] Oragene Collection kit 무료샘플 사용해보세요!! (7.31까지)
다온비에스 다온비에스
[DNAGenotek] Omnigene·GUT Collection Kit 무료샘플 사용해보세요!! (7.31까지)
브래디 브래디
초저온라벨 등 실험실용 풀칼라프린터 (COVID-19 안전사인 지원) (8.30까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
High Multiplex RNA/Protein Expression Analysis System / taco.. (12.24까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
[TECAN] Reading과 형광 Imaging을 하나의 장비로 한 번에!! [Multi-mode micr.. (8.31까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
[에펜도르프코리아] Eppendorf 2020 상반기 프로모션 안내 : 실험실 필수품 피펫,원심분리기,PCR.. (8.8까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
5/6  좌우
52,60050,000
482,000
49,000
468,000
23,000
92,30087,700
143,800136,700
136,000129,200
339,400322,500
47,20044,900
125,500119,300
139,000132,100
130,500124,000
493,000
109,000
79,50075,600
66,50063,200
773,000734,400
370,000
93,20088,600
482,000
6,000
17,000
739,000702,100
최근등록   더보기 >
DMA-80 수은분석기 오염 잡는방법 알려주세요!ㅜㅜ   07.12
식물의 잎을 이용해 전분을 만들었을 때, 그 성분이 남아있는지 궁금합니다   07.12
Cck-8   07.12
TSB배지로 증균액 만들기   07.12
평판도말법 도말평판법   07.12
akta fplc 사용해보신 분 계실까요?   07.12
마우스 정맥주사 후 다시 주사 가능한 기간 질문입니다.   07.11
A.flavus paper disc 실험   07.11
Hepes solutin이 HBS랑 같은건가요?   07.11
용액을 희석시 DW말고 다른 용액으로 제조가 가능한가요?   07.11
울산대학교 의과대학
제품평가
[비아이코퍼레이션]
e브릭몰(연구용 제품 온라인 구매 사이트)
비아이코퍼레이션
모집인원: 50명
모집기간: ~7/15까지
신청조건: BRIC 회원
평가자 혜택

- 참가자 전원 3만원 상품권 제공

제품평가자 모집중
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크