[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
이엔셀
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
BioLab 장재봉 교수
전체보기 안전점검 LABox
 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
조회 3910  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 pcr 시행시 pipetting 오차를 줄이기 위해서
알쏭이쏭(과기인)  | 2019.07.18 14:06

안녕하세요, 요즘 pcr을 수행하고 있는 초보 연구자 입니다.

제가 SYBR kit로 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 3ul total 9ul로 맞추고 cDNA를 1ul 씩 넣어주거든요.

먼저 9ul 씩 qPCR 용 well에 넣어준 후 cDNA 1ul씩 넣어줍니다.

근데 가끔씩 튀는 값이 있어요. relative conc가 0.3,0.2, 이러다가 4이러는 경우가 있습니다. 물론 Triplicate하고요, Triplicate끼리는 거의 값 차이는 없습니다.

저는 qPCR도 triplicate하지만 sample도 triplicate 해서 실험해서(6well plate에서  3개well이 같은 조건) 토탈 qPCR에서는 9개 동일값이 나오게됩니다..근데 꼭 한 샘플, 즉 9개 중 3개가 가끔씩 농도가 이상하게 높게 나오는 경향이 있어요...

그래서 pipetting 실력이 부족한가 싶어서 좀 수정해서 다시 실험해 볼까 합니다.

cDNA 희석을 해서 넣어준다고들 하던데, 그렇게 되면 다른 넣어주는 component도 다 볼륨을 해당 배수만큼 넣어주어야 하는 거죠?

다른 질문자들에 대한 답변을 읽어봐도 정확히 이해되지 않아 질문드립니다 ㅠㅠ 도와주세요 ㅠㅠ

#qPCR
 
#cDNA 희석
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이Molang  |  2019.07.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cDNA 희석을 한다고 하면,

예를 들어 20ng/ul인 샘플을 10ng/ul의 농도로 만들어서 2배의 cDNA, 즉 2ul를 loading하는 것이라고 생각합니다.

그렇게 되면 

 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 3ul total 9ul 가 아니고

 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 2ul total 8ul가 됩니다.

그리고 cDNA 2ul를 넣으시면 됩니다.

개구리AstV  |  2019.07.19   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
최근에 저도 2ul피펫 고장을 겪다보니..
1ul 0.5ul 딸때 표면장력때문에 제대로 안따질때도 있어요.

차라리 지금 프라이머를 2배 더 희석하고, 희석액들을 동량씩 섞어서 프라이머 믹스쳐를 만든 다음, 이걸 2ul 넣어주면 차이가 좀 줄것같네요. 거기에 cDNA는 3배 희석해서 3ul씩 반응에 이용하면 되고요.

premix 5ul, primer mixture 2ul, total 7ul로 맞추고 cDNA를 3ul

이렇게 하시면 편하실 겁니다.
superbio  |  2019.07.22    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Triplicate끼리는 값차이가 없다? 면 단순히 pipetting 오차가 아니라 

RNA prep. 문제일수도 있습니다. 

RNA뽑고 정량하는 과정에서 이미 오차가 발생한다면, 오차 없이 cDNA를 넣어줘도 결과값은 튀는 값이 나옵니다. 

알쏭이쏭  |  2019.07.23   

세 분 모두 정말 감사드립니다.

이해가 잘 되었습니다!

언젠가 저도 도움이 되는 사람이 될 수 있기를...

답변하기
할인행사/신제품신기술 광고 검색광고
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
[TECAN 한국공인대리점] TECAN Microplate reader/ IMPLEN Nanophotomet.. (4.11까지)
모아바이오 모아바이오
[AFG Scientific] *새해맞이* 20% 특가 할인 프로모션! 2만가지이상의 모든 ELISA Kit.. (2.28까지)
인성크로마텍 인성크로마텍
[Fluidic Analytics] Complex background 에서의 농도(conc.) 및 결합 친화..
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
무중력으로 스트레스 없이 3D 세포 배양 최적화!
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
효율적인 Genome Editing의 필수조건은?
코람바이오텍 코람바이오텍
[Cell Signaling Technology] Primary Antibody 전제품 20% 할인 행사 (2.28까지)
최근등록   더보기 >
실험쥐에 물렸습니다..   02.03
unknown peak height가 다르게 나오는 이유   02.02
nitrile glove 투과도   02.02
고체, 액체 시약별 stock solution 제조   02.02
Real time PCR로 해당 cell의 특정 mRNA 발현 여부   02.02
웨스턴블롯 단백질 사이즈   02.02
전기영동 버퍼 관련 질문   02.02
colony PCR 예상 밴드   02.02
gaussview 6.0 프로그램   02.02
세포 분화 질문입니다!!! 꼭 답변 부탁드립니다 ㅜㅜㅜㅜ   02.02
최근답변자 우수답변자
대왕개구리SPEED

올챙이해조칼슘풍덩

대왕개구리강시

알오리5리Oh..

앞다리됴엥

개구리범수리

알돌굴러가유

개구리oneday

개구리Kim

개구리빛초롱

개구리겨우살이

개구리secu

개구리Daegu*

개구리지나가는사람

대왕개구리강시

꽃개구리발그런

실험관련연재
세오 연재중실전 실험 프로토콜 101
세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크 광고