[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
웨비나모집
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
조회 548  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 pcr 시행시 pipetting 오차를 줄이기 위해서
알쏭이쏭(과기인)  |  07.18 14:06

안녕하세요, 요즘 pcr을 수행하고 있는 초보 연구자 입니다.

제가 SYBR kit로 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 3ul total 9ul로 맞추고 cDNA를 1ul 씩 넣어주거든요.

먼저 9ul 씩 qPCR 용 well에 넣어준 후 cDNA 1ul씩 넣어줍니다.

근데 가끔씩 튀는 값이 있어요. relative conc가 0.3,0.2, 이러다가 4이러는 경우가 있습니다. 물론 Triplicate하고요, Triplicate끼리는 거의 값 차이는 없습니다.

저는 qPCR도 triplicate하지만 sample도 triplicate 해서 실험해서(6well plate에서  3개well이 같은 조건) 토탈 qPCR에서는 9개 동일값이 나오게됩니다..근데 꼭 한 샘플, 즉 9개 중 3개가 가끔씩 농도가 이상하게 높게 나오는 경향이 있어요...

그래서 pipetting 실력이 부족한가 싶어서 좀 수정해서 다시 실험해 볼까 합니다.

cDNA 희석을 해서 넣어준다고들 하던데, 그렇게 되면 다른 넣어주는 component도 다 볼륨을 해당 배수만큼 넣어주어야 하는 거죠?

다른 질문자들에 대한 답변을 읽어봐도 정확히 이해되지 않아 질문드립니다 ㅠㅠ 도와주세요 ㅠㅠ

#qPCR
 
#cDNA 희석
답변하기
검색광고 검색광고
[정코퍼레이션] Cryogenic Barcode Labels -196℃ to +100℃
초저온 냉동(-80℃),액체질소(-196℃),액체질소증기(-150℃) 촉으로 인한 라벨 표시가 떨어짐 현상이 있는 경우에 적합하며, Deep Freezer,LN2 Tank 보관,냉동고용 식별 및 저장에 이상적입니다.
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cDNA 희석을 한다고 하면,

예를 들어 20ng/ul인 샘플을 10ng/ul의 농도로 만들어서 2배의 cDNA, 즉 2ul를 loading하는 것이라고 생각합니다.

그렇게 되면 

 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 3ul total 9ul 가 아니고

 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 2ul total 8ul가 됩니다.

그리고 cDNA 2ul를 넣으시면 됩니다.

올챙이Molang  |  07.18 22:14  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
최근에 저도 2ul피펫 고장을 겪다보니..
1ul 0.5ul 딸때 표면장력때문에 제대로 안따질때도 있어요.

차라리 지금 프라이머를 2배 더 희석하고, 희석액들을 동량씩 섞어서 프라이머 믹스쳐를 만든 다음, 이걸 2ul 넣어주면 차이가 좀 줄것같네요. 거기에 cDNA는 3배 희석해서 3ul씩 반응에 이용하면 되고요.

premix 5ul, primer mixture 2ul, total 7ul로 맞추고 cDNA를 3ul

이렇게 하시면 편하실 겁니다.
개구리AstV  |  07.19 13:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Triplicate끼리는 값차이가 없다? 면 단순히 pipetting 오차가 아니라 

RNA prep. 문제일수도 있습니다. 

RNA뽑고 정량하는 과정에서 이미 오차가 발생한다면, 오차 없이 cDNA를 넣어줘도 결과값은 튀는 값이 나옵니다. 

superbio  |  07.22 18:13   

세 분 모두 정말 감사드립니다.

이해가 잘 되었습니다!

언젠가 저도 도움이 되는 사람이 될 수 있기를...

알쏭이쏭  |  07.23 16:00  
답변하기
할인행사 광고 검색광고
마크로텍 마크로텍
Ezscope Nikon 현미경 마이크로톰 특가판매 (12.30까지)
엠피바이오메디칼스코리아 엠피바이오메디칼스코리아
샘플파쇄 단 40초! 비드호모게나이저 특별할인행사: 가격할인+사은품 증정 (12.31까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
βeta
5/6  좌우
121,700
82,800
137,600131,000
218,200
231,000219,000
107,200102,000
231,000219,000
286,700
123,900118,000
668,600334,000
286,700
130,00065,000
286,700
286,700
113,500108,000
79,80076,000
144,900138,000
49,700
56,70054,000
286,700
101,90097,000
50,50048,000
180,700172,000
286,700
최근등록   더보기 >
HepG2 cell에서 ROS 실험을 진행중입니다   10.15
HPLC 제품의 당류(설탕) 분석시 UV Detecter.   10.15
HPLC 제품의 당류(설탕) 분석시 UV Detecter.   10.15
TCGA data   10.15
gapdh 발현   10.15
DNA희석시에 DW로 희석하나요..?   10.15
RIPA buffer와 T-per buffer의 차이점   10.15
MIN6 cell 분양 관련   10.15
살짝 보관에 실패한 FBS는 cell의 생존에 얼마나 영향을 끼칠까요?   10.15
protease inhibitor에 관한 질문입니다.   10.14
아이빔테크놀로지
투표진행
Q. 영문교정 맘에드는곳(?) 은 어디였나요
참여하기
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크