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 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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질문 pcr 시행시 pipetting 오차를 줄이기 위해서
알쏭이쏭(과기인)  | 2019.07.18 14:06

안녕하세요, 요즘 pcr을 수행하고 있는 초보 연구자 입니다.

제가 SYBR kit로 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 3ul total 9ul로 맞추고 cDNA를 1ul 씩 넣어주거든요.

먼저 9ul 씩 qPCR 용 well에 넣어준 후 cDNA 1ul씩 넣어줍니다.

근데 가끔씩 튀는 값이 있어요. relative conc가 0.3,0.2, 이러다가 4이러는 경우가 있습니다. 물론 Triplicate하고요, Triplicate끼리는 거의 값 차이는 없습니다.

저는 qPCR도 triplicate하지만 sample도 triplicate 해서 실험해서(6well plate에서  3개well이 같은 조건) 토탈 qPCR에서는 9개 동일값이 나오게됩니다..근데 꼭 한 샘플, 즉 9개 중 3개가 가끔씩 농도가 이상하게 높게 나오는 경향이 있어요...

그래서 pipetting 실력이 부족한가 싶어서 좀 수정해서 다시 실험해 볼까 합니다.

cDNA 희석을 해서 넣어준다고들 하던데, 그렇게 되면 다른 넣어주는 component도 다 볼륨을 해당 배수만큼 넣어주어야 하는 거죠?

다른 질문자들에 대한 답변을 읽어봐도 정확히 이해되지 않아 질문드립니다 ㅠㅠ 도와주세요 ㅠㅠ

#qPCR
 
#cDNA 희석
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이Molang  |  2019.07.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cDNA 희석을 한다고 하면,

예를 들어 20ng/ul인 샘플을 10ng/ul의 농도로 만들어서 2배의 cDNA, 즉 2ul를 loading하는 것이라고 생각합니다.

그렇게 되면 

 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 3ul total 9ul 가 아니고

 premix 5ul, primer 0.5/0.5ul, Dw 2ul total 8ul가 됩니다.

그리고 cDNA 2ul를 넣으시면 됩니다.

개구리AstV  |  2019.07.19   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
최근에 저도 2ul피펫 고장을 겪다보니..
1ul 0.5ul 딸때 표면장력때문에 제대로 안따질때도 있어요.

차라리 지금 프라이머를 2배 더 희석하고, 희석액들을 동량씩 섞어서 프라이머 믹스쳐를 만든 다음, 이걸 2ul 넣어주면 차이가 좀 줄것같네요. 거기에 cDNA는 3배 희석해서 3ul씩 반응에 이용하면 되고요.

premix 5ul, primer mixture 2ul, total 7ul로 맞추고 cDNA를 3ul

이렇게 하시면 편하실 겁니다.
superbio  |  2019.07.22    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Triplicate끼리는 값차이가 없다? 면 단순히 pipetting 오차가 아니라 

RNA prep. 문제일수도 있습니다. 

RNA뽑고 정량하는 과정에서 이미 오차가 발생한다면, 오차 없이 cDNA를 넣어줘도 결과값은 튀는 값이 나옵니다. 

알쏭이쏭  |  2019.07.23   

세 분 모두 정말 감사드립니다.

이해가 잘 되었습니다!

언젠가 저도 도움이 되는 사람이 될 수 있기를...

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