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질문 이론 단백질크기와 실제 단백질크기가 달라요
알날아라완두콩(대학원생)  |  07.18 10:09

안녕하세요 석사 1차학기 중인 대학원생입니다.

 

얻고자 하는 단백질의 크기는 약 60kDa 이지만, 발현하여 얻어 SDS-PAGE 하여 보인 밴드의 위치는 래더와 비교하여 보았을 때 70kDa 였습니다.

 

pET32a 벡터를 사용하였고, 아직 tag는 제거하지 않은 상황입니다.

 

DNA 레벨에서 시퀀싱을 맡겼을 때도, 종결코돈 위치도 이상이 없었습니다.

 

이렇게 10 kDa 정도 차이나는 경우가 있나요?!

#단백질
 
#단백질크기
 
#SDSPAGE
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

antibody 회사랑 cell line 별로 크기 차이가 날 수도 있고, protein post-modification에 따라서도 size가 증가할 수도 있습니다~

개구리kakaoblack99  |  07.18 12:49  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

단백질의 경우 marker 조차도 100% 실제 size와 일치하지 않습니다. 그렇기 때문에 target protein의 경우 비슷한 위치에서 up 또는 down shift 되었다고 하더라고 근처에 뚜렷하게 main band가 보이면 target protein 이라고 판단할 수 있습니다.

특히 단백질은 post-tranlational modification이 다양하고 세포의 종류에 그 modification pattern이 다양할 수 있기 때문에 100% 일치하는 위치에 band가 반드시 잡히는 것은 아닙니다.

실험에서 예상위치보다 높게 나왔다고 하더라고 명확한 band로 보인다면 원하는 단백질이라고 믿으면 되겠습니다.

 

개구리식스센스  |  07.18 13:13  

Fusion 단백질을 제거하지 않았다면 fusion 단백질 때문으로 보이네요.

pET32a는 E.coli expression vector로 Thioredoxin과 fusion된 형태로 단백질을 발현시킵니다.

따라서, E.coli에는 post-translational modification이 없으며, thioredoxin이 약 11KDa 정도이므로, 순수한 내 단백질 크기가 60 KDa이라면, fusion 단백질은 대략 70KDa 정도가 되는 거죠.

분자량 마커는 순수한 단백질과 prestained marker간에 분자량 차이가 있습니다. 이미 염색된 것은 순수한 단백질보다는 분자량이 크게 나옵니다. 반면 샘플은 전기영동 후 염색하기 때문에 원래 분자량을 나타냅니다. 동일한 종류의 단백질을 사용한 분자량 마커라도 회사별로, 동일회사라도 batch별로 실제 크기가 조금씩 다를 수 있습니다. 마커와 분자량 비교 시 이러한 차이를 고려하여 비교해야 합니다.

앞다리DTer  |  07.22 19:16  
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