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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 PCR 할때마다 자꾸 mutation이 생깁니다 ...
올챙이naregi(과기인)  |  2019.07.17 13:52

안녕하세요. 답답한 마음에 결국 브릭까지 찾아왔네요 ㅠㅠ

주변에 여쭤볼 만한 분들도 안계시고..포닥 선생님들 조차도 잘 모르시는 부분이어서 혹시나 여기에는 아실만한 분이 계실까, 안계시더라도 조언을 구하고자 간절한 마음으로 여쭙니다 ...

요즘 conventional PCR로 cloning을 무지 많이 하고 있는데요.

polymerase는 당연히 pfu를 쓰고 있습니다. E.coli vector에서 mammalial vector로 옮기는 작업일 뿐인데..최근 한두달전부터 자꾸 mutation이 발생합니다.

같은 위치도 아닌데 신기한 것은 대부분의 문제가 'C(cytosine)'에서 발생한다는 것입니다. 불특정한 위치에서 유독 'C'만 adding/deletion/간혹 'T'로 replacement ...난리입니다.

시퀀싱을 해보면 peak은 매우 깔끔합니다.

이러한 mutation을 교정하고자 recombinant PCR을 진행하면! 진행하면!!!

교정하고자 했던 시퀀스는 교정이 되고 ...다른 C가 또 말썽입니다.

정말 미치겠습니다...

도대체 왜 이런걸까요 ? 혹시나 하는 마음에 최근 시약을 몽땅 새것으로 바꿨는데도 동일한 현상이 반복되고 있습니다.

귀견 부탁드립니다 선배님들...감사합니다...!

#PCR
 
#cloning
 
#sequencine
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.07.17   

일반 taq을 사용해도 mutation 없이 cloning이 가능한데 이상하네요..

1. 전체 증폭하는 gene 크기가 얼마인가요?

2. 증폭 cycle은 얼마나 하나요?

3. mutation 된 "C"은 몇번 염기에 위치해 있나요?

4. mutation은 교정하지 말고 다시 PCR하는 것이 좋습니다.

5. 염기 서열 분석은 한번에 몇개를 분석하나요?

6. PCR에서 mutation되는 "C"의 위치는 랜덤하게 바뀌나요?

올챙이naregi  |  2019.07.18   

1. 전체 증폭하는 gene 크기가 얼마인가요?

----- 800bp정도 입니다.

2. 증폭 cycle은 얼마나 하나요?

----- max.로 35cycle 돌립니다.

3. mutation 된 "C"은 몇번 염기에 위치해 있나요?

----- 늘 다른 위치에 발생합니다. 대부분 C가 2~3개 반복되는 곳에서 나타납니다. target gene의 3'보다는 5'쪽에서 자주 발생합니다.

4. mutation은 교정하지 말고 다시 PCR하는 것이 좋습니다.

5. 염기 서열 분석은 한번에 몇개를 분석하나요?

----- ligation과 transformation 후 몇개의 colony를 분석하냐는 말씀이신거죠? 3개에서 많게는 12개까지 합니다.

6. PCR에서 mutation되는 "C"의 위치는 랜덤하게 바뀌나요?

----- 네,  개중에서도 빈도수가 높은 위치가 있긴합니다.(5' 엔자임사이트 근처)

 

SPEED님 관심 가져주셔서 대단히 감사합니다.!

대왕개구리SPEED  |  2019.07.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

TF 후 3 ~ 12개 colony를 염기서열 분석하는데 "C" mutation이 일어나지 않은

colony가 하나도 없다구요?

현재 사용하는 Pfu를 사용하지 말고 일반 taq을 사용해서 증폭하고 cycs을

25cycs만 돌려서 product를 사용하세요..

800pb 정도면 mutation이 생길 정도의 길이는 절대 아닙니다.

 

올챙이naregi  |  2019.07.18   

감사합니다 ... 제가 생각해도 너무 황당한 시츄에이션이긴 합니다 ..ㅎㅎ

말씀해 주신 점에 유의해서 원인를 찾을때까지 다시 정진해보겠습니다...!

고냉이  |  2019.07.19    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

위에 speed님 말씀대로,

일반적으로 클로닝용 PCR이라면 cycle #가 많기는 합니다.

25-27 cycles 가 적당합니다.  1 cycle 마다 돌연변이 발생확률이 증가하니까요.

아주 큰 영향이라기보다는 이론적으로 그렇죠. 

그리고 답변중에 5'엔자임사이트에 주로 mutation이 많다고 하셨는데

혹시 발생위치가 PCR에 사용하는 primer 위치인지요?

그런 경우라면  primer를 다시 합성하시는 게 어떠실지요?

저 같은 경우는 클로닝을 자주 하기는 하는데,

경험상 약 1% 확률로 primer 위치에 돌연변이가 발생하더군요.

이 경우는 oligo 합성 상의 어쩔수 없는 문제라고 생각되는데,

위분의 경우 primer 위치에 돌연변이가 발생하는데

말씀하신대로 발생확률이 높다면 합성시 문제가 있었지 않나 싶네요.

유전자 중간의 다른 위치에 발생한다면,  GC contents가 높거나  이차구조가 있거나 그런지요?

구조가 안 좋으면 pfu가 그부분을 제대로 복제못하고 다른 걸로 대충 대체하기도 합니다. PCR 조건을 바꿔주거나 그런 구조를 풀어주는 다른 시약을 약간 첨가해보시면 좋을 듯합니다.

시약이 기억나질 않는데, 인터넷 검색해보시면 나올겁니다.

실험하시는 분 답답한 심정이 느껴져서 혹시나 도움이 될까 글 남깁니다.

무더운 여름에 건강 조심하시고

문제점 잘 해결하시길 바랍니다.

경험상  |  2019.07.20    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

그럴때는 시약 뿐만 아니라 모든 것을 바꿔줘야 합니다. ㅜㅜ

이유는 나중에 연구하고 싹 다 바꾸세요.

c. cell은 새로운 스탁에서 긁어서 콜로니를 따서 접종해서 새로 만들고

템플레이트 플라스미드를 그 c.cell에 넣어서 새로 프렙하고 

프라이머를 새로 dilution 하고 

물 시약 다 바꾸고 

miniprep kit도 웬만하면 옆방에서 한 번 빌려 쓰세요. ㅜㅜㅜ

제가 이런 경험이 있어봐서 그 심정을 잘 압니다 ㅜㅜㅜ

올챙이naregi  |  2019.07.26   

감사합니다 선배님들!

시간에 쫓겨서 하다보니 일이 이렇게 꼬이나봅니다..ㅎㅎ

급할수록 돌아가라고 실타래가 더 꼬여서 아예 못풀때까지 생고생 하지 말고 지금이라도 싹 다 갈아치우고 다시 해보렵니다!

올챙이naregi  |  2019.08.09   

혹여나 저같이 미궁속에 빠지는 분들이 또 계실까 하는 마음에 달려왔습니다.

여러분께서 귀견 주신 덕분에 문제가 해결되었다 생각합니다.!

그저 conventional PCR일 뿐이라 여러가지 조건을 테스트하고 확인하고 할 여유가 제게는 없어서 제 생각에 가장 의심스러운 부분인

1. cloning을 위한 enzyme site를 포함하고 있는 PCR primer set

2. PCR cycle 수 (기존 35 cycle-->25cycle)

이 두가지 요소만 바꿔서 진행한 결과, 실타래  풀리듯 그간 문제가 있던 것들이 주루룩 성공적으로 진행되고 있습니다!!(pfu, taq 간의 차이는 없었습니다.)

SPEED님, 고냉이님 정말 감사합니다!

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