일반 taq을 사용해도 mutation 없이 cloning이 가능한데 이상하네요..
1. 전체 증폭하는 gene 크기가 얼마인가요?
2. 증폭 cycle은 얼마나 하나요?
3. mutation 된 "C"은 몇번 염기에 위치해 있나요?
4. mutation은 교정하지 말고 다시 PCR하는 것이 좋습니다.
5. 염기 서열 분석은 한번에 몇개를 분석하나요?
6. PCR에서 mutation되는 "C"의 위치는 랜덤하게 바뀌나요?
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naregi
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19.07.18 11:08
1. 전체 증폭하는 gene 크기가 얼마인가요?
----- 800bp정도 입니다.
2. 증폭 cycle은 얼마나 하나요?
----- max.로 35cycle 돌립니다.
3. mutation 된 "C"은 몇번 염기에 위치해 있나요?
----- 늘 다른 위치에 발생합니다. 대부분 C가 2~3개 반복되는 곳에서 나타납니다. target gene의 3'보다는 5'쪽에서 자주 발생합니다.
4. mutation은 교정하지 말고 다시 PCR하는 것이 좋습니다.
5. 염기 서열 분석은 한번에 몇개를 분석하나요?
----- ligation과 transformation 후 몇개의 colony를 분석하냐는 말씀이신거죠? 3개에서 많게는 12개까지 합니다.
6. PCR에서 mutation되는 "C"의 위치는 랜덤하게 바뀌나요?
----- 네, 개중에서도 빈도수가 높은 위치가 있긴합니다.(5' 엔자임사이트 근처)
SPEED님 관심 가져주셔서 대단히 감사합니다.!
TF 후 3 ~ 12개 colony를 염기서열 분석하는데 "C" mutation이 일어나지 않은
colony가 하나도 없다구요?
현재 사용하는 Pfu를 사용하지 말고 일반 taq을 사용해서 증폭하고 cycs을
25cycs만 돌려서 product를 사용하세요..
800pb 정도면 mutation이 생길 정도의 길이는 절대 아닙니다.
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naregi
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19.07.18 15:42
감사합니다 ... 제가 생각해도 너무 황당한 시츄에이션이긴 합니다 ..ㅎㅎ
말씀해 주신 점에 유의해서 원인를 찾을때까지 다시 정진해보겠습니다...!
위에 speed님 말씀대로,
일반적으로 클로닝용 PCR이라면 cycle #가 많기는 합니다.
25-27 cycles 가 적당합니다. 1 cycle 마다 돌연변이 발생확률이 증가하니까요.
아주 큰 영향이라기보다는 이론적으로 그렇죠.
그리고 답변중에 5'엔자임사이트에 주로 mutation이 많다고 하셨는데
혹시 발생위치가 PCR에 사용하는 primer 위치인지요?
그런 경우라면 primer를 다시 합성하시는 게 어떠실지요?
저 같은 경우는 클로닝을 자주 하기는 하는데,
경험상 약 1% 확률로 primer 위치에 돌연변이가 발생하더군요.
이 경우는 oligo 합성 상의 어쩔수 없는 문제라고 생각되는데,
위분의 경우 primer 위치에 돌연변이가 발생하는데
말씀하신대로 발생확률이 높다면 합성시 문제가 있었지 않나 싶네요.
유전자 중간의 다른 위치에 발생한다면, GC contents가 높거나 이차구조가 있거나 그런지요?
구조가 안 좋으면 pfu가 그부분을 제대로 복제못하고 다른 걸로 대충 대체하기도 합니다. PCR 조건을 바꿔주거나 그런 구조를 풀어주는 다른 시약을 약간 첨가해보시면 좋을 듯합니다.
시약이 기억나질 않는데, 인터넷 검색해보시면 나올겁니다.
실험하시는 분 답답한 심정이 느껴져서 혹시나 도움이 될까 글 남깁니다.
무더운 여름에 건강 조심하시고
문제점 잘 해결하시길 바랍니다.
그럴때는 시약 뿐만 아니라 모든 것을 바꿔줘야 합니다. ㅜㅜ
이유는 나중에 연구하고 싹 다 바꾸세요.
c. cell은 새로운 스탁에서 긁어서 콜로니를 따서 접종해서 새로 만들고
템플레이트 플라스미드를 그 c.cell에 넣어서 새로 프렙하고
프라이머를 새로 dilution 하고
물 시약 다 바꾸고
miniprep kit도 웬만하면 옆방에서 한 번 빌려 쓰세요. ㅜㅜㅜ
제가 이런 경험이 있어봐서 그 심정을 잘 압니다 ㅜㅜㅜ
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naregi
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19.07.26 09:49
감사합니다 선배님들!
시간에 쫓겨서 하다보니 일이 이렇게 꼬이나봅니다..ㅎㅎ
급할수록 돌아가라고 실타래가 더 꼬여서 아예 못풀때까지 생고생 하지 말고 지금이라도 싹 다 갈아치우고 다시 해보렵니다!
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naregi
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19.08.09 11:12
혹여나 저같이 미궁속에 빠지는 분들이 또 계실까 하는 마음에 달려왔습니다.
여러분께서 귀견 주신 덕분에 문제가 해결되었다 생각합니다.!
그저 conventional PCR일 뿐이라 여러가지 조건을 테스트하고 확인하고 할 여유가 제게는 없어서 제 생각에 가장 의심스러운 부분인
1. cloning을 위한 enzyme site를 포함하고 있는 PCR primer set
2. PCR cycle 수 (기존 35 cycle-->25cycle)
이 두가지 요소만 바꿔서 진행한 결과, 실타래 풀리듯 그간 문제가 있던 것들이 주루룩 성공적으로 진행되고 있습니다!!(pfu, taq 간의 차이는 없었습니다.)
SPEED님, 고냉이님 정말 감사합니다!