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 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
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질문 RIPA buffer사용했는데 pellet이 젤리같아요.
알오곡의힘(대학생)  |  07.16 16:45

RIPA로 DP cell lysis시키고 centrifuge 했는데 pellet이 절리처럼 만들어져요.

몇번 해봤는데 똑같이 젤리처럼 떠요,

pellet을 pipet으로 제거해보긴 하는데 좀 찜찜하고 깨끗하지가 않아요.

이거 왜 이런건지, 해결방법 아시는 분 계신가요?

#RIPA
 
#lysis
 
#pellet
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

DNase를 처리하면 점성이 사라집니다.

대왕개구리SPEED  |  07.16 16:56  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

DNA에 의한 현상입니다. DNase를 처리해보세요.

뒷다리초보자구해줘요  |  07.16 17:04  

혹시 Lab.에서 일반적으로 사용하시는 DNase 농도가 어느 정도 인지 말씀해주실 수 있나요?

궁금해요  |  07.17 17:51   

DNase I을 5U ~ 20U / ml 농도로 처리하면 됩니다.

대왕개구리SPEED  |  07.17 18:27  
가장 간단한 방법은 pipetting을 끈적임이 없어질 때까지 수십회 반복해서 chromosomal DNA를 잘게 잘라 주는 방법입니다.

DNase I은 lysis buffer에 EDTA 혹은 EGTA를 사용하는 경우 활성이 떨어질 수 있고, SDS 나 deoxycholate가 포함된 RIPA buffer에서 최적 활성을 나타내는지는 의문이네요.

강한 detergent  없이 freeze/thaw로 세포를 깨는 경우는 사용 가능할 것으로 보입니다만, DNase I은 실험 조건을 먼저 고려한 후 선택하는 것이 맞을 것으로 생각됩니다.
앞다리DTer  |  07.19 11:31  

원래그런거 맞습니다.

 

DNA 때문에 끈적거리는 겁니다.

 

DNA는 Backbone 자체가 당구조로 되어있어서 

 

DNA가 많이 있으면 끈적끈적 한 젤리처럼 보입니다.

 

RIPA buffer로 하면 그렇게 되는 이유는

RIPA buffer는 강력한 detergent를 포함하는 버퍼라서

Nucelues membrane까지 깨버리기 때문에 Chromosomal DNA들이 노출되서 그런 현상이 나타나는 것입니다.

 

참고하세요

올챙이판다의브레인  |  07.19 21:47  

genomic DNA가 노출되서 나타나는 현상이고...

 

파이펫팅을 수십회 반복하거나 하다가 파이펫 안으로 들어갈 수 있으니

조심해서.

 

또는 DNase I 를 처리하거나

 

소니케이터로 3-5초 정도 가장 약한 세기로 지이이잉 해주면 해결됩니다..

 

그도 아니면 파이펫으로 건져서 버려도 됩니다.. 크로마틴에 결합된 단백질

보실 게 아니라면..

올챙이더잘하고싶다  |  07.20 06:42  
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