먼저 168 균주가 -Trp 배지에서 안자라는지 다시한번 확인해 보세요.
그리고 integration 확율이 낮은 것은 integration vector의 casette구조를
봐야지 알수 있을 것 같습니다.
integration casette가 잘 만들어 졌으면 TF되면 gDNA에 integration이 되기
때문에 TF 효율 = integration 효율이 나옵니다.
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레벨2
지이두
(대학원생)
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19.07.16 15:55
168은 trp-에서 안자라는걸 확인했습니다ㅠㅠ
colony가 너무 많이 떠서 이유가 뭔지....
integration cassette에는 앞뒤로 amyE gene 각각 700, 900 bp 정도에
가운데에 원하는 gene 3kb정도가 들어있습니다ㅠㅠ 그 중에 lipA promoter와 trpC gene이 있구요ㅠ
vector를 잘라서 TF 하나요?
vector가 integration되지 않고 vector 상태로 168 cell 안에 있는건 아닌지..
TF 후 자란 colony 3개 정도 plasmid prep.을 한번 해보세요.
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레벨2
지이두
(대학원생)
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19.07.16 20:54
amyE~amyE부분만 PCR로 amplicon을 얻어서 DNA로 사용하고 있습니다...
Bacillus ori가 없어서 발현이 불가할 뿐만 아니라 colony PCR로 확인했을 때도 trpC gene이 증폭되지 않아서... 이런 경우가 가능한건지 의문입니다ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
casette만 TF 했다면 TF 후 자란 colony에서 gDNA를 분리하여 AmyE,
target gene, TrpC 등 이 3개의 gene을 PCR로 증폭해 보세요.
TF한 균주가 -Trp에서 자랐으니까 cell 내부에서 gene 들이 어떻게
배열되었는지 확인을 해볼수 밖에 없을 것 같습니다.
--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---
위의 구조로 casette가 연결되어있다면
1. AmyE F & R
--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---
---------------------------------------------------------------------------
2. Target gene F & R
--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---
------------------------
3. TrpC F & B
--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---
---------------------
4. AmyE F & target gene R
--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---
--------------------------------------
5. Target gene F & AmyE R
--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---
--------------------------------------------------------------
6. AmyE-F & TrpC-R
--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---
--------------------------------------------------------------
위의 6가지를 PCR로 gDNA에서 증폭되는지 확인해 볼 필요가 있을 것
같습니다.
추가적으로 gDNA에 들어갔는지 확인은 168균주 gDNA 서열에서 AmyE
상류로 300bp, 하류로 300bp 서열로 primer를 만들어 gDNA에 들어 갔는지
확인해 볼수도 있습니다.
PCR 증폭이 안되고 -trp 배지에서 자랐다면 168균주에서 plasmid를 분리해서
확인해 보는 것이 필요할 것 같습니다.
casette 단편은 AmyE F & R로 증폭해서 만들었다면 관계없는데 vector에서
casette를 만들고 casette부분만을 잘라서 사용했다면 vector 오염 가능성도
고려해봐야 할겁니다.
한가지 명확한 것은 TrpC gene이 현재 TF한 168균주 안에 분명히 있을겁니다.