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 전체 > Microbiology > Bacteria
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질문 bacillus genomic integration
알지이두(대학원생)  |  07.15 16:37

bacillus subtilis 168 gDNA에 plasmid를 integration 하려고 하는데요

bacillus subtilis transformation방법이랑 똑같이 하는데, 그와중에 낮은 확률로 integration되는 경우가 있는 것이라고 알고 있는데요,

integrative gene이 없는 plasmid를 transformation했을 때보다 integrative gene이 있는 plasmid(혹은 필요한 부분만 PCR한 amplicon)를 transformation했을 때 콜로니는 훨씬 많이 뜨고 제대로 integration된 경우는 찾을 수 없었습니다ㅠ

trpC gene을 이용해서 제대로 integration이 된 경우 trp- 배지에서 자랄 수 있다는 점을 이용해서 걸러내고 있는데요, 왜 콜로니가 엄청 많이 뜨는걸까요ㅠ

 

#integration
 
#plasmid
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

먼저 168 균주가 -Trp 배지에서 안자라는지 다시한번 확인해 보세요.

그리고 integration 확율이 낮은 것은 integration vector의 casette구조를

봐야지 알수 있을 것 같습니다.

integration casette가 잘 만들어 졌으면 TF되면 gDNA에 integration이 되기

때문에 TF 효율 = integration 효율이 나옵니다.

대왕개구리SPEED  |  07.15 18:35  

168은 trp-에서 안자라는걸 확인했습니다ㅠㅠ

colony가 너무 많이 떠서 이유가 뭔지....

integration cassette에는 앞뒤로 amyE gene 각각 700, 900 bp 정도에
가운데에 원하는 gene 3kb정도가 들어있습니다ㅠㅠ 그 중에 lipA promoter와 trpC gene이 있구요ㅠ

알지이두  |  07.16 15:55  

vector를 잘라서 TF 하나요?

vector가 integration되지 않고 vector 상태로 168 cell 안에 있는건 아닌지..

TF 후 자란 colony 3개 정도 plasmid prep.을 한번 해보세요.

 

대왕개구리SPEED  |  07.16 17:27  

amyE~amyE부분만 PCR로 amplicon을 얻어서 DNA로 사용하고 있습니다...

Bacillus ori가 없어서 발현이 불가할 뿐만 아니라 colony PCR로 확인했을 때도 trpC gene이 증폭되지 않아서... 이런 경우가 가능한건지 의문입니다ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ

알지이두  |  07.16 20:54  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

casette만 TF 했다면 TF 후 자란 colony에서 gDNA를 분리하여 AmyE,

target gene, TrpC 등 이 3개의 gene을 PCR로 증폭해 보세요.

TF한 균주가  -Trp에서 자랐으니까 cell 내부에서 gene 들이 어떻게

배열되었는지 확인을 해볼수 밖에 없을 것 같습니다.

--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---

위의 구조로 casette가 연결되어있다면

1. AmyE F & R

--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---

  ---------------------------------------------------------------------------

2. Target gene F & R

--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---

                     ------------------------

3. TrpC F & B

--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---

                                                          ---------------------

4. AmyE F & target gene R

--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---

  --------------------------------------

5. Target gene F & AmyE R

--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---

                     --------------------------------------------------------------

6. AmyE-F & TrpC-R

--AmyE-F---Target-F---Target-R---TrpC-F---TrpC-R--AmyE-R---

  --------------------------------------------------------------

위의 6가지를 PCR로 gDNA에서 증폭되는지 확인해 볼 필요가 있을 것

같습니다.

추가적으로 gDNA에 들어갔는지 확인은 168균주 gDNA 서열에서 AmyE

상류로 300bp, 하류로 300bp 서열로 primer를 만들어 gDNA에 들어 갔는지

확인해 볼수도 있습니다.

PCR 증폭이 안되고 -trp 배지에서 자랐다면 168균주에서 plasmid를 분리해서

확인해 보는 것이 필요할 것 같습니다.

casette 단편은 AmyE F & R로 증폭해서 만들었다면 관계없는데 vector에서

casette를 만들고 casette부분만을 잘라서 사용했다면 vector 오염 가능성도

고려해봐야 할겁니다.

한가지 명확한 것은 TrpC gene이 현재 TF한 168균주 안에 분명히 있을겁니다.

대왕개구리SPEED  |  07.16 21:31  
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