당연히 cloning에 사용하는 효소자리는 ORF 안에 없어야 합니다.
EcoRI과 BamHI으로 잘라서 vector에 넣을 때 ORF에 해당 효소자리가 있으면
ORF가 잘라지기 때문에 cloning이 불가능합니다.
ATG에서 하류로 forward primer 23mer를 기준으로 Tm을 계산해 보고
종결코돈 TAA 상류로 reverse primer 23mer를 기준으로 Tm을 계산해서
두 primer의 Tm이 비슷하게 나오고 60 ~ 65도 정도 나오면 그 서열을
primer로 사용하면 됩니다.
ATG 앞에 EcoRI, TAA 뒤에 XhoI 서열을 붙이고 T vector에 cloning했다가
pCDH-RFP에 cloning하려면 바로 PCR하면 됩니다.
T vector를 거치지 않고 pCDH-RFP에 바로 cloning하려면 PCR 증폭 후
제한효소 cut 효율을 높이기 위해서 EcoRI 앞에 3개~5개 정도 염기,
XhoI 뒤에 3개~5개 정도 염기를 랜덤하게 넣어서 primer를 만들면 됩니다.
이해가 안되는 부분은 다시 질문을 주세요.
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레벨5
kakaoblack99
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19.07.18 13:01
primer design하는건 아는 사람은 길어야 30분이면 하는 작업인데, 처음 배우는 입장에서는 모든 원리를 이해해야 하니 힘든 작업입니다ㅎㅎㅎ
"Speed" 님이 과정을 세부적으로 잘 설명해 주셨는데 아마 이해가 잘 안되실 꺼예요.
한 줄 한 줄 왜 그렇게 말씀하셨는지 pcr에 대해 공부하시면서 이해하시면 아마 나중에도 크게 도움이 될 듯합니다.
타켓 gene의 enzyme site 유무부터 확인하셔야 할것 같습니다.
보통 vector map에 MCS site가 존재하기 때문에 그걸 참고하셔서
http://nc2.neb.com/NEBcutter2/
위 링크에서 확인해보세요~
타겟 gene에 enzyme site가 없는 MCS site 중 골라서
sequence를 넣어 primer를 제작하면 됩니다.
gagagttaGAATTCaccATGGAGAGCCCCAAAAAGAAGAACCAGCAGCTGAAAGTCGGGATCCTACACCTGGGCAGCAGACAGAAGA
AGATCAGGATACAGCTGAGATCCCAGTGCGCGACATGGAAGGTGATCTGCAAGAGCTGCATCAGTCAAAC
ACCGGGGATAAATCTGGATTTGGGTTCCGGCGTCAAGGTGAAGATAATACCTAAAGAGGAACACTGTAAA
ATGCCAGAAGCAGGTGAAGAGCAACCACAAGTTTAActcgagAAGGTTCG
gene이 짧던데 dsDNA 합성가능한 업체에 의뢰해도 큰 돈 안들이고 가능하겠네요
밑줄친 primer pair로 60oC에서 10cycle 돌리고 68oC에서 20 cycle 돌리면 ~250 bp band가 보일 것입니다.