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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 저번에 라이게이션 문의했던 학생입니다.
뒷다리졸업은언제하나(대학원생)  |  07.13 19:51

안녕하세요^,^

 

저번에 라이게이션이 안된다고 문의 글 올렸던 학생입니다.

(저번 문의글은 여기: http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=663839&ksr=1&FindText=ligation)

 

정말 감사하게도 또 이것저것 많이 조언해주셔서 그동안 시도를 해보았는데요....저는 이번에도 콜로니 없는 빈 플레이트를 얻었습닏 ㅠ ㅠ

 

먼저,

원래 실험 클로닝 실험 방법은 아래와 같습니다.

합성한 pUC57, pET23a+ 트포한 DH5a를 O/N접종한 배양액 -> DNA prep->Enzyme cut->gel에서 각각 Vector, Insert DNA에 해당하는 band 잘라서 gel extraction -> ligation

 

ligase 반응 온도, 시간, 농도를 변경해보기도하였고,

65℃ inactivation도 생략해보았고,

Fresh한 DH5a comcell(10^8)에 TF도 진행해보았고, 

TF를 하는 DNA양과 Com cell의 양도 늘려보았는데

하나같이 아무것도 콜로니가 뜨지 않았습니다.

 

Enzyme site도 sequencing을 통해서 모두 정상인 것을 확인하였는데...

정말로 아무것도 안떠서..

 

혹시나 하는 마음에 self-ligation을 진행하였는데요...

O/N접종한 배양액 -> DNA prep->Enzyme cut->gel에서 각각 pUC57의 V와 I, pET23a+의 V와 I의 DNA에 해당하는 band 잘라서 gel extraction -> pUC57의 V+I, pET23a+의 V+I의 self ligation

self ligation 진행한 용액을 DH5a com cell에 TF 하였으나, 아무 콜로니도 뜨지 않았습니다.

 

O/N 배양액에서 prep한 DNA를 TF하였을 경우에는 소량이어도 TF가 되었는데,

gel extraction 후 ligation을 진행한 것은 어떠한 것도 TF가 되지 않아서

 

혹시 gel extraction이 잘못된 것은 아닐까 하는 의심이 되었습니다.

 

현재는 G사에서 판매중인 DNA prep kit와 gel extraction kit를 사용중인데요..

 

혹시 gel extraction kit에서 문제가 생기셨던분은 안계실까요?

저번에 SPEED님께서 알려주신 ETOH 방법으로도 진행을 해보려하긴하는데..

혹시 gel extraction 과정에서 DNA에 손상을 받았던 분이 계실까요?

 

저희가 G사안녕하세요^,^

 

 

 

저번에 라이게이션이 안된다고 문의 글 올렸던 학생입니다.

 

(저번 문의글은 여기: http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=663839&ksr=1&FindText=ligation)

 

 

 

정말 감사하게도 또 이것저것 많이 조언해주셔서 그동안 시도를 해보았는데요....저는 이번에도 콜로니 없는 빈 플레이트를 얻었습닏 ㅠ ㅠ

 

 

 

먼저,

 

원래 실험 클로닝 실험 방법은 아래와 같습니다.

 

합성한 pUC57, pET23a+ 트포한 DH5a를 O/N접종한 배양액 -> DNA prep->Enzyme cut->gel에서 각각 Vector, Insert DNA에 해당하는 band 잘라서 gel extraction -> ligation

 

 

 

ligase 반응 온도, 시간, 농도를 변경해보기도하였고,

 

65℃ inactivation도 생략해보았고,

 

Fresh한 DH5a comcell(10^8)에 TF도 진행해보았고, 

 

TF를 하는 DNA양과 Com cell의 양도 늘려보았는데

 

하나같이 아무것도 콜로니가 뜨지 않았습니다.

 

 

 

Enzyme site도 sequencing을 통해서 모두 정상인 것을 확인하였는데...

 

정말로 아무것도 안떠서..

 

 

 

혹시나 하는 마음에 self-ligation을 진행하였는데요...

 

O/N접종한 배양액 -> DNA prep->Enzyme cut->gel에서 각각 pUC57의 V와 I, pET23a+의 V와 I의 DNA에 해당하는 band 잘라서 gel extraction -> pUC57의 V+I, pET23a+의 V+I의 self ligation

 

self ligation 진행한 용액을 DH5a com cell에 TF 하였으나, 아무 콜로니도 뜨지 않았습니다.

 

 

 

O/N 배양액에서 prep한 DNA를 TF하였을 경우에는 소량이어도 TF가 되었는데,

 

gel extraction 후 ligation을 진행한 것은 어떠한 것도 TF가 되지 않아서

 

 

 

혹시 gel extraction이 잘못된 것은 아닐까 하는 의심이 되었습니다.

 

 

 

현재는 G사에서 판매중인 DNA prep kit와 gel extraction kit를 사용중인데요..

 

 

 

혹시 gel extraction kit에서 문제가 생기셨던분은 안계실까요?

 

저번에 SPEED님께서 알려주신 ETOH 방법으로도 진행을 해보려하긴하는데..

 

혹시 gel extraction 과정에서 DNA에 손상을 받았던 분이 계실까요?

 

 

 

저희가 G사의 Expin 제품을 사용중인데,

혹시 다른 국내 제품을 추천해주실 수 있으신가요?

 

 

감사합니다^^

 

 

 

#gel extraction
 
#cloning
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문제가 복잡한 것 같지만 cloning은 원칙만 잘 치키면 상당히 simple한

실험 입니다.

V와 I를 연결해서 V + I form의 plasmid를 얻으면 됩니다.

1. 사용한 CP cell에 아무 vector를 TF해서 colony 수를 직접 확인해 봤나요?

2. ligation에 사용한 vector와 insert의 전기영동 사진과 ligation 후의 전기영동

사진이 있나요?

3. gel extraction 시 DNA 말단에 문제가 생긴다는 얘기는 들어본적이

없구요 gel elution 후 전기영동으로 DNA를 확인해서 회수 양에 문제가

없으면 사용하면 됩니다.

그리고 ligation 후 전기영동에서 ligation 반응이 어느정도 되었으면 TF 후

colony를 찾을 수 있습니다.

4. TF는 어떤 방법으로 하나요?

대왕개구리SPEED  |  07.13 20:07  
첨부파일 파일첨부: gel_DH5a.jpg (483 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요, SPEED님.

항상 감사드립니다^^

 

말씀해주신 것들을 모아서 이미지로 준비했습니다.

 

1. 아무 vector를 DH5a com cell에 TF 하였을 경우,

com cepp 50 ul, 30 ul + com cell 볼륨의 10%만큼의 DNA 비율로 각각 O/N incubation을 하였을 경우

첫번째 두 플레이트 처럼 콜로니가 떴습니다.

 

2,3. ligation 전 후를 비교한 gel 사진인데,

저날 만들어놓은 gel의 background가 너무 쎄서 잘 보이지는 않지만

ligation 전후의 V, I, V+I band를 확인하실 수 있습니다.

ligation 후 V보다 큰 band를 확인할 수 있지만, TF 후 LB/Amp (50 ul/ml) plate O/N incubation시 콜로니가 뜨지 않았습니다.

 

4. 저희 연구실에서는 RBC 회사의 HIT Competent Cells-DH5alpha Value 108 제품을 사용중입니다.

해당 제품은 non-heatshock 프로토콜로 제작된 제품으로, 다음의 과정을 통해 TF가 가능한 제품입니다.

DH5a + ~10% 볼륨의 vector 을 섞어준 후

10 min ice incubation

LB/Amp plate에 spreading 후 O/N 37℃ 배양

 

 

감사합니다^^

뒷다리졸업은언제하나  |  07.15 17:02  

앞전 질문과 이번 질문에서 동일하게 느껴지는 것은 vector와 insert가

잘 준비되었는지 확인이 잘안됩니다.

가장 중요한 요인의 확인이 잘 안되니 먼저 vector와 insert의 ligation 전 및

ligation 후 전기영동 사진을 다시 만들어 보는게 좋을 듯합니다.

그리고 전기영동 사진은 사진이 목적이 아니라 실험이 잘되는지 혹은 문제가

없는지 확인하는 중요한 수단입니다.

background가 높아서 확인이 안되면 가장 확인이 잘되는 조건으로 다시

전기영동 해서 vector와 insert의 ligation 전, 후의 상태를 확인하는것이

cloning이 가능할지 못할지 추정이 가능합니다.

대왕개구리SPEED  |  07.15 17:58  
첨부파일 파일첨부: Enzyme cut.JPG (44 KB)
이미지 첨부파일

실험에 사용한 V와 I는 Enzyme cut을 진행 후 겔영동으로 확인 및 겔 extraction을 해서 받은 것입니다.

 

pET-23a+의 경우 Nde1과 Hind3를이용해서 다른 DNA (900~1000 bp)가 삽입되어있는 vector입니다.

 

pUC57, pET23a+ 모두 Nde1과 Hind3 cut 해서 size 마커로 크기 확인 후 수거한 것입니다.

 

Gel extraction 후 겔 영동해서 확인하였을 경우 V와 I모두 크기에는 차이가 없었기에 ligation을 진행하였는데, 콜로니가 뜨지 않습니다 ㅠ_ㅠ

 

겔 영동기 크기에서도 큰 차이를 보이지 않는데, ligation이 되지 않으니 어느부분을 수정해야할지 모르겠습니다.

 

감사합니다.

뒷다리졸업은언제하나  |  07.15 18:36  

아래 사진에서 elution 후의 v(pET23a+), i(pUC57) 그리고 ligation 후(v+i)의

양이 너무 적습니다

전기영동에 사용한 DNA양이 1회 TF할 때 사용하는 양인가요?

만약 그렇다면 v, i, v+i를 현재의 3배 ~ 5배정도 양을 올려 전기영동해보세요.

ligation pattern의 확인이 잘 안됩니다.

upload_image

그리고 CP cell의 TF 효율을 확인할 때는 CP cell 부피대비 DNA를 사용하는

것이 아니라 DNA의 ug단위로 실험해야지 판단하기가 용이 합니다.

예를 들어 5ul, 3ul의 vector를 사용하면 vector의 농도가 그때그때 달라질수

있기 때문에 0.1ug 또는 0.3ug 이렇게 무게단위로 TF해서 colony를 확인해

보세요.

또한 위의 전기영동 사진에 있는 v + i에 사용한 DNA양은 얼마입니까?  

대왕개구리SPEED  |  07.15 18:49  

감사합니다 SPEED님^.^

 

Gel extraction 후 DNA양을 그때그때 측정하긴 하는데, 

보통 Insert가 3.2ng/ul, vector가 1.7 ng/ul 정도 회수가 됩니다.

Ligation에는 insert를 12 ul, vector를 5 ul정도 섞어주며 (T4 ligase 1 ul, T4 buffer 2 ul),

전기영동에는 insert와 vector를 약 5ul씩, ligation mixture를 13 ul 정도 로딩합니다.

 

말씀하셨던 부분 중 DNA를 볼륨단위가 아닌 무게 단위로 수정해서 다시 진행해 보겠습니다.

 

DNA의 양은 최대한 높은 농도로 진행하려고 해보고있으나, gel extraction과정에서 손실이 너무 많아서 따로 농축 (EtOH 같은 것)을 알아보고있습니다.

 

항상 감사드립니다!^.^

뒷다리졸업은언제하나  |  07.15 22:16  

pUC57, pET23a의 전기영동 사진을 볼때는 gel elution 해서 사용할 양이

충분합니다.

위의 pUC57, pET23a의 enzyme cut 전기영동 사진에서 1개 well에 loading한

DNA양은 몇 ul정도 되나요?

그런데 gel elution 후 양이 너무적게 나오네요.

현재 진행하는 ligation mixture로는 clone을 찾기가 힘들겁니다.

실험이 안되는 원인은 충분한 v, i를 준비하지 못한것에 있습니다.

gel elution 후 양이 적어서 무조건 EtOH 농축을 한다고 좋은것은 아니구요.

처음 elution 할때 적정한 DNA 수율을 얻는것이 좋습니다.

혹시 gel elution kit는 어떤 걸 사용하고 gel elution 실험 순서를 자세히 알려

주실수 있을까요?

분명히 잘못하고 있는것이 있습니다.

요즘 gel elution kit의 수율이 평준화 되어 수율이 잘 안나오면 거의 실험자의

실수에서 기인할 겁니다. 

대왕개구리SPEED  |  07.15 22:53  

안녕하세요^.^

 

조금 전에 측정하고 왔는데,

한 lane 당

Vector의 경우 1.5 ug, Insert의 경우 4 ug를 Enzyme cut (37℃, 3 h)하여 총 20 ul 볼륨으로 반응 시킨 후, 전기영동을 합니다.

전기영동으로 band 확인 후, gel extraction을 진행하고있습니다.

 

Gel extration kit는 Geneall 사의 Expin Gel SV제품을 사용중이고,

실험은 

1. Enzyme cut 후 전기영동을 하여 insert와 vector band를 잘라내서 

2. 두 덩어리씩을 하나의 튜브에 넣습니다.

3. 두 덩어리가 담긴 튜브의 무게를 측정하고, GB buffer로 50℃에서 gel을 녹입니다. (5~10분)

4. 녹인 용액을 컬럼에 로딩하여 13000 rpm에서 1 min 동안 cfg 합니다.

5. 700 ul washing (NW) buffer로 washing 후 남은 buffer를 날리기 위해 추가로 1 min 더 cfg 합니다.

6. 컬럼의 membrane위로 elution buffer (50 ul)를 로딩하여 cfg합니다.

 

Gel extraction 후 나오는 vector와 insert의 농도가 위에서 말씀드린 것 처럼 한자리수 ng/ul 정도의 수율을 가지고 있습니다.

다른 곳에 문의를 해보니, ligation 시 약 50~100 ng (많게는 200)의 vector를 반응시킨다고 해서

저희 연구실에서 ligation이 안되는 이유 중 하나가, 말씀해주신 것 처럼 너무 적은 것 같습하니다.

 

전체적으로 extraction 후 받는 DNA의 양이 너무 적어서, gel extraction 과정 중 의심하는 부분이..

Gel에서 band를 자를 때, 같이 잘려오는 agarose gel의 양이 너무 많은 것이 아닌가 라는 의심도 하고 있습니다.

 

물론 gel extraction과정의 효율을 높이면 정말 좋을텐데요...만약 높아지지 않을 때를 생각해서 농축하는 방법을 찾아보았는데요..

EtOH 방법이 적합하지 않을 것 같다고 하셔서, 다른 과 학생에게 물어보니 자기들 연구실은 동결건조기나 evaporator를 이용하여 DNA를 농축해서 사용하기도 한다고 합니다.

 

제가 물어봤던 연구실과 저희 연구실이 같은 회사의 kit를 사용하고있는데,

이러한 문제가 저희한테만 나오는 것 같습니다.

말씀해주신 것 처럼, 분명 저희 연구실 내에서 gel extraction 과정에서 실수를 하고 있는 것 같은데 어느 부분에서 문제가있는지 확실하지 않은 것 같습니다 ㅠ_ㅠ

 

바쁘신 시간 내주셔서 매번 답변을 해주시는데 

매번 정말 감사드립니다.

뒷다리졸업은언제하나  |  07.16 16:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Gel extration kit 사용법은 상당히 간단합니다.

경험적으로 간단한 실험에서 결과가 잘 안나오면 가장 간단한 곳에서

실수가 있는 경우가 많습니다.

2. 두 덩어리씩을 하나의 튜브에 넣습니다.

: gel 무게 대비 항상 일정한 양의 GB buffer를 넣으세요.

3. 두 덩어리가 담긴 튜브의 무게를 측정하고, GB buffer로 50℃에서 gel을 녹입니다. (5~10분)

: 이 단계는 55도~60도에서 진행하고 녹이는 시간 보다 완전히 녹았는지

확인하고 다음 단계로 넘어 가는것이 좋습니다.

보통 15분 안에 거의 다 녹지만 3분에 한번씩 tube를 inverting 해주세요.

한번에 5회정도 inverting을 하고 총 3min X 3 ~ 4회 정도 inverting을 하면

100% 다녹을 겁니다.

5. 700 ul washing (NW) buffer로 washing 후 남은 buffer를 날리기 위해 추가로 1 min 더 cfg 합니다.

: NW는 70% EtOH가 맞는지 다시 한번 확인해보세요.

이 과정은 2회 정도 진행해 주고 두번째 원심분리 후에는 실온에서 5분간

건조를 해주세요.

6. 컬럼의 membrane위로 elution buffer (50 ul)를 로딩하여 cfg합니다.

: 이 과정은 30ul를 먼저 컬럼에 넣고 37도에서 5~10분간 방치 후 원심분리,

그리고 또 30ul를 넣고 37도에서 5~10분간 방치 후 원심분리하면 됩니다.

총 57~58ul 정도 나올겁니다.

이중에서 v, i 각각 1ul, 3ul를 전기 영동 해보세요.

- 다른 곳에 문의를 해보니, ligation 시 약 50~100 ng (많게는 200)의 vector를

반응시킨다고 해서..

: 저는 항상 vector를 0.1~0.2ug정도 사용을 합니다.

거의 모두 한번에 cloning을 성공한것 같습니다.

- Gel에서 band를 자를 때, 같이 잘려오는 agarose gel의 양이 너무 많은 것이

아닌가 라는 의심도 하고 있습니다.

: Band를 잘라낼때 인접한 band가 없다면 최대한 target band를 포함시켜

잘라내고 인접한 band가 있을 경우는 target band를 버리면서 인접 band의

오염을 막는 것이 좋습니다.

농축은 EtOH 방법이 좋지 않는 것이 아니라 불순물도 농축되기 때문에

plasmid prep.이나 gel elution이나 초기 시료의 양은 어느정도 확보하는것이

중요합니다.

당연히 잘되는 gel elution이 잘 안된다고 농축만 계속하면 실험 실력이

부분적으로 향상되지 않을 겁니다.

위에 적어 놓은 방법으로 gel elution하면 분명히 잘될겁니다.

대왕개구리SPEED  |  07.16 17:18  

항상 감사드립니다 SPEED님ㅜ.ㅜ

 

바쁘실텐데 자세히 조언해주셔서 감사드립니다.

오늘 마침 gel extraction을 진행 할 예정이니,

조언해주신 부분 반영해서 이번엔 실험을 성공해 보겠습니다..!!

 

 

항상 감사드립니다^.^♥

뒷다리졸업은언제하나  |  07.16 18:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 아무 vector(잘리지 않은)를 TF 하면 원래 잘됨 --> 그러나 그림상 보다는 훨씬 많은 콜로니가 나올거로 예상 됨

2. 사용하는 comp cell을 reaction mixture 와 섞고 ice에서 10분, 42C에서 heatshock 1분, 다시 ice에서 1분--> 1ml LB 넣고 37C에서 한시간 shaking-->그리고 cell을 spreading 

지나가다  |  07.17 10:28   

DNA는 ul가 아니라 ug 단위로 표기해야 합니다. 1번에서 아무 vector를 3, 5 ul TF 했다고 했는데 정량값이 얼마인가요? 정확한 값은 모르겠지만 일단 ng 단위로 썼을 때도 콜로니가 떡이 되게 나와야 합니다. 정상적인 vector로도 TF 효율이 저 정도면 ligation 하는건 안 나오는게 맞겠죠. 

ㅇㅇ  |  07.17 13:48   

몇자 의견 남깁니다.

1) Transformation 효율

사용하고 계신 Transformation kit (competent cell)을 사용해본적은 없지만,

Competent cell : ligated vector 의 부피비도 중요합니다.

competent cell 대비 vector의 볼륨이 크면, transformation 버퍼조성이 변경되어 효율이 크게 떨어질 수 있습니다. 볼륨비가 protocol상에 나와있다면 protocol대로 해보시고, 안나와있다면 볼륨비 조절도 해보세요.

그리고 사용중인 competent의 cell의 원리는 모르겠지만, 사용중이신 ligase와 호환성에는 문제가 없나요? ligase 버퍼에 있는 어떤 조성이 transformation을 방해할 수도 있습니다.

 

2) ligation 효율

저는 NEB T4 ligase의 경우 37도에서 2시간 이상해왔었고, NEB Quick ligase는 RT(21도 정도)에서 15분정도 해왔었습니다. 오래전이라 확실친 않지만, 이렇게 했을 때, insert의 monomer는 거의 안보였었습니다. 선생님 결과를 보면 monomer가 절반정도가 그대로 남아있네요.

 

3) insert 중간에 hind3/Nde1이 없는것은 당연히 확인됬겠지요?

개구리순똘  |  07.17 17:41  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

사용하는 vector 양이 굉장이 적은 양인것 같은데요...

vector 양 30~50ng 사용하시고..

insert와의 비율을 1:3, 1:10, 1:100으로 진행해보세요..

비율은 정량값이 아니라 mole수로 계산해야됩니다..

elution되는 양이 굉장이 적기때문에 비율 맞추기가 힘들 수도 있겠네요..

enzyme cut 하실 때 vector를 10ug 정도 자르고 elution해보세요..

난난  |  07.18 18:14   

앗 제가 실험을 하고 결과를 받아오는 사이에 많은 분들게서 답변을 해주셨었군요..!!

 

agarose 를 바꾸니 높은 농도의  DNA를 회수할 수 있었습니다..!

그래서 vector기준으로 150 ~ 200 ng 당 mol 수 대비 1:3과 1:10으로 라이게이션을 진행해서,

콜로니를 받았습니다.

 

아무래도 컴셀의 효율이 낮다라는 말씀을 해주셨어서,

평소에 50 ~ 100 ul의 컴셀 (RBC-HIT non-heatshock DH5a)을 200 ul로 높여서 진행하였더니 콜로니가 떴습니다*,*

DNA 전기영동으로 확인 후 시퀀싱 보내서 서열 확인도 모두 완료하였습니다!!

 

 

ㅠ ㅠ클로닝이 2달째 안되서 졸업을 미뤄야하나 했는데

이렇게 많은 분들 덕분에

실험적인 조언도 많이 얻고, 클로닝도 성공했습니다.

 

이제 발현정제만 하면....되..되는데...

그것도..ㅠ,ㅠ 잘 부탁드립니다.

 

다들 바쁘신데 감사드립니다.

더운데 건강 조심하시고, 좋은일만 있으시길 바랍니다^_^

뒷다리졸업은언제하나  |  07.30 15:28  
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