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질문 genomic DNA
올챙이z크핫z(대학생)  |  07.12 17:09
첨부파일 파일첨부: 질문.PNG (86 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요 저는 새내기 대학원생입니다.

MDA-ME 231 로 genomic DNA추출 후 1% 전기영동을 하고 보니 밴드가 깨지진 않았지만 흐르는 현상이 있었습니다. 브릭에 질문을 하고 답변을 듣고  다시 해 보았으나... 제가 쓰는 건 AccuPrep-Genomic-DNA-Kit  이거 이고요 과정중에 흰색의 머리카락 처럼 엉켜있는 것을 볼수가 있는데요 이것을 풀어줘야 하나요 아니면 조심히 그래로 실험을 계속하면 되나요.  친구에게 물어보니까 흰 가닥이 gDNA라고 했습니다. 맞나요?

 

사진을 보면 맨 위에는 밴드가 뜨는데 연하게 뜨며 밴드가 깔끔하지 않습니다... ㅜㅜ

#gDNA
 
#genomic
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

첨부 사진 처럼 나오면 gDNA가 분해되어 분리된것입니다.

조금 더 전체 과정을 mild하게 진행하는 것이 좋습니다.

gDNA는 분자량이 크기 때문에 EtOH 침전을 하면 실처럼 침전이 되고

dry 후 DW나 buffer에 녹이면 다 녹을 때까지 시간이 조금 걸릴수 있습니다.

손으로 tube를 친다든지 충격을 주지말고 DW나 buffer를 넣고 냉장고에

1시간 이상 넣어 두면 다 녹기 때문에 다 녹인 후 잘 피펫팅 해서 전기영동

으로 확인해 보면 됩니다.

혹시 Lab에 페놀 buffer가 있나요?

저는 kit를 잘 사용안하는 편인데 mannual로 gDNA를 잘 뽑을수 있는 방법을

알려드릴까 합니다.

필요하면 답변주세요..

대왕개구리SPEED  |  07.12 19:00  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Bioneer사의 kit 사용하시는거같은데 해당kit를 저희 실험실에서도 사용합니다.

근데 컬럼 방식의 kit라서 딱히 흰색 실? 같은게 생성될게 없습니다.

DNA prep의 문제라 생각되시면, 다시한번 시도해보심이 어떨까요?

 

그리고 전기영동시에 loading buffer 양을 줄여보세요 (D.W 희석하시면 됩니다)

loading buffer가 DNA에 비해 너무 많이 들어가도 아래쪽에 background가 생깁니다.

이드  |  07.13 09:42   

DNA 10ul + loading buffer 2ul 로 해서 전기영동 내렸습니다. ㅠㅜ

올챙이z크핫z  |  07.15 09:41  

speed 님 그러면 실 같은것을 다음 washing buffer을 넣고 시간을 두고 난 다음에 실험을 해도 괜찮을까요? ㅜㅜ 여기 kit는 wahing을 2번 하는데 두번다 시간을 두고 실험을 해야 하나요? ㅠㅠ

올챙이z크핫z  |  07.15 10:35  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

washing은 연속으로 하는게 좋습니다.

그리고 실같은 것이 정확히 어느 단계에서 생기나요?

대왕개구리SPEED  |  07.15 18:51  
첨부파일 파일첨부: ㅈㅁ.PNG (57 KB)
이미지 첨부파일

1. Centrifuge the cultured cells (10⁴-10⁶) for 5min at 300 x g. Discard the supernatant carefully without disturbing the pellet.

2. Resuspend the pellet in 200 μl of 1xPBS. 

3. Add 20 μl of Proteinase K (see “Before you begin”) to the each tube. 

4. Add 10 μl of RNase A (see “Before you begin”) to each tube and incubate the tubes for 2min at room temperature. 

5. Go to step 3of “DNA Extractionfrom Whole BloodandBuffy Coat” in page 4 and continuethe instructions accordingly.

6. Add 200 μl of GB Buffer to the sample and mix immediately by vortex mixer.

(You must completely resuspend the sample to achieve maximum lysis efficiency)

7. Incubate at 60℃ for 10 min.

8. Add 400 μl of absolute ethanol and mix well by pippetting.

(After this step, briefly spin down to get the drops clinging under the lid.)

이때 ethanol 로 pippetting 할때 흰 실같은 것이 보입니다.

그리고 말씀해 주신것 처럼 tip 앞을 넓게 자르고 옮겼습니다.

9. Carefully transfer the lysate into the upper reservoir of the Binding column tube (fit in a collection tube) without wetting the rim.

  • 질문이요 혹시나 해서 실 같은 것을 힘것 풀었는 것 과 살살 풀어서 로딩을 해 보았더니 다음과 같은 밴드가 형성 되었습니다.

 

 

올챙이z크핫z  |  07.16 08:47  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

오른쪽 well은 어느정도 분해도 안되고 gDNA가 분리되었네요.

제일 아래 band들은 RNA입니다.

마지막 gDNA 용액에 사용하는 RNAase를 1ul 넣어서 사용하면 RNA가 모두

분해됩니다.

대왕개구리SPEED  |  07.16 15:50  

그러면 흰 실같은 것을 풀어야하나요.....
아님 풀지 말고 dry 시킨후 buffer에 녹이나요... ㅠㅠ

올챙이z크핫z  |  07.16 17:38  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

8. Add 400 μl of absolute ethanol and mix well by pippetting.

: 잘 혼합하되 강한 힘으로 혼합하지 마세요.

이때 실같이 생긴 gDNA는 그냥 천천히 컬럼에 넣으세요.

컬럼에 lysate를 넣고 원심분리 후 washing 2회 진행하고  실온에서 5분간 건조

후  elution buffer를 넣고 5~10분간 37도에 방치하고 난후 원심분리하면됩니다.

elution과정은 1/2부피로 나누어 2회를 진행하는 것이 좋고 binding된

gDNA는 plasmid와 같이 빨리 elution되지 않기 때문에 37도에서 elution시키는

것이 좋습니다.

예를 들어 50ul를 elutin 할 경우 30ul X 2회를 elution하는 것이 좋습니다.

대왕개구리SPEED  |  07.16 17:57  

질문에 대한 답변 정말 감사합니다!

올챙이z크핫z  |  07.17 08:28  
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