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장기간 보관한 시료문제일지 확인해 보세요..
배양된 세포등으로 pAKT가 나올수 있게 PC를 구성해 놓고 내 동결조직 샘플과 동시에 진행해서 시험상에 문제인지 샘플상에 문제인지 구별해야 될것 같습니다.
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레벨1
mickeymouse
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19.07.15 10:58
안티바디 시트에 나와있는 postive control로도 확인해보셨나요?
저희도 가끔 안나오거나 제 위치에서 뜨지 않는 경우 postive control 로 확인해서 안티바디가 제대로 working 하는지 보고 실험해서요~
여유 되신다면 함 확인해보세요!
일반 동결 조직은 인산화를 보는 것이 적합하지 않을 수 있다.
세포내 단백질 활성 조절에서 가장 민감하게 조절되는 방법 중 하나가 인산화-탈인산화를 통한 조절이다. 어떤 경우는 수초~수분이내에 인산화가 일어나고 탈인산화가 일어난다. 이러한 이유로 인산화를 보기 위해서는 lysis buffer에 탈인산화 저해제를 반드시 포함시켜야 한다. 그렇지 않으면 탈인산화 효소가 인산기를 제거하여 인산화 형태의 단백질을 관찰할 수 없다.
동결 조직의 경우, 탈인산화효소 저해제가 없는 동결과정 혹은 해동과정에서 탈인산화 효소에 의해 인산기가 제거될 수 있다.
조직에서 인산화를 관찰하기 위해서는 조직의 일부를 탈인산화효소 저해제가 포함된 lysis buffer로 lysis 시킨 후 tissue homogenate 혹은 lysate 상태로 냉동 보관하여야 한다.
일반 냉동 조직에서 인산화된 단백질을 볼 수 없는 이유는, 실험 방법에 의한 문제 가능성도 배제할 수는 없지만, 샘플이 문제일 가능성이 더 크다.