그렇다 하기에는...
저 3가지는 일반적으로 실험자 혹은 위탁업체가 DNA를 확보할수 있는 방법입니다.
시퀀싱을 보내는 실험자가 어떤 방법이 가장 쉬울지 또 DNA 확보가 용이할지를 생각해보세요...
gel extraction은 내가 오린 밴드만 시퀀싱을 하고 싶을때
pcr product는 내가 PCR 한 tube의 DNA를 시퀑실하고 싶을때
prep은 셀안에 있는 DNA를 내가 prep 하기 귀찮을때 이정도 일것 같네요
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레벨4
happyday1324
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19.07.12 10:35
purification, gel extraction, cloning 이 세가지 모두 다른회사에 맡겨서 일을 할 수 있는 회사들이 많이들 있습니다.
우선 기본적으로 pcr product가 있다고 가정하에.
purification은 불순물을 제거하는 정제 실험.
gel extraction은 다른 multi로 뜨는 밴드들을 제외하고 순수하게 target band만 얻고 싶을때 하는 실험.
cloning은 유전자를 추출해서 벡터에 삽입시키는 실험.
이라고 저는 생각합니다. ㅎㅎ,,,
질문에 맞지 않는 답이라면 죄송합니당..
만약 본인이 직접 실험을 하지 않고, 다른 회사에 맡겨서 일을 진행 하 실 경우, 대부분 시퀀싱을 하는 회사에 cloning을 하는 팀이 있을것으로 생각합니다.
pcr product를 보내고 부가적인 실험(purification, gel extraction)들을 맡아서 하는 팀도 있으니, 한번 찾아보시면 좋을껏 같습니다.
서열을 확인하는 목적에 따라 PCR fragment 혹은 클로닝 벡터에 삽입된 형태로 확인하게 된다.
단순히, PCR primer를 제외한 PCR fragment 내부 서열 확인만으로 충분한 정보를 제공하는 경우는 번거로운 클로닝 과정 없이 PCR product를 정제 혹은 특정 band를 gel extration하여 서열을 확인한다.
예를 들어, 서열의 특정 부분이 각기 다른 균주의 경우 그 특정 서열 부분만 확인하면 어떤 균주인지 확인 가능하다. 이 경우는 균주 동정이 목적이므로 특정 서열을 증폭한 후 PCR fragment 형태로 내부 서열을 확인하는 것으로 충분하다. 즉, 클로닝이 필요없다.
반면, 클로닝하여 단백질을 발현하거나 다른 벡터로 2차 클로닝을 하는 경우, DNA fragment의 서열과 변이 여부를 확인하는 것 외에, 클로닝한 자리에 제대로 클로닝이 되었는지, codon frame에 문제가 없는지를 확인하여야 한다. 이 경우, DNA fragment 서열뿐만 아니라 클로닝한 제한 효소자리까지 확인하여야 한다.
Sequencing 반응은 primer에 해당하는 서열은 확인할 수 없다. 따라서 클로닝한 자리까지 확인하기 위해서는 벡터의 클로닝 제한효소 서열 바깥에 위치한 sequencing primer를 사용하여야 클로닝 위치에 제대로 삽입되었는지, 클로닝 방향은 맞는지 등을 확인할 수 있다. 이 경우는 클로닝한 벡터 형태로 서열을 확인하여야 한다.