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 전체 > Cell Biology > Cell Culture
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질문 트립신 처리해도 cell이 잘떨어지지 않아요.
올챙이lovedanial(대학생)  |  07.08 16:20

트립신은 그대로이구요.

pbs wash후 trypsin 2ml정도 넣고 incubator에 3MIN 둡니다.

 

그리고 파이펫으로 세게 media 넣어야 cell이 떨어집니다.

심지어 안떨어지는 애들고 있구요... 왜그런걸까요?

#etc
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

그 이유는 셀을 떼는데 3분이 부족한거겠죠...

시간을 늘리시면 됩니다.... 그럼 얼마나 늘려야 하냐면... 현미경상으로 확인하시면서 시간을 잡으시면 됩니다.... 현미경상 시간이 지남에 따라 둥둥 떠다니게 되는게 이게 왠만큼 떨어지면 파이펫팅으로 싱글셀까지 만들수 있습니다.

금개구리안재진  |  07.08 17:29  

cell washing 할때 Ca(-), Mg(-) PBS  쓰시는 거 맞죠?

칼슘과 마그네슘이 셀 adherent에 도움을 주기때문에  칼슘과 마그네슘이온이 없는PBS로 washing 하셔야 합니다.

알깨비스콘  |  07.09 23:17  

먼저 셀 종류가 무엇인가요? 저는 체세포 실험의 경우로 해서 설명할께요....

1-1. 트립신은 activity가 매우 중요합니다.

바로 사용할 경우 4도에 보관하며 1~2주 정도 보관 추천드리구요...

이 이상 기간경과시 액티비티 많이 떨어져서 셀 처리시 시간이 오래걸리고... 파이페팅시 셀 손상이 많이 일어납니다.

또한 사용시 상온에 오래 보관시 이것을 몇번 반복하게되면 액티비티가 빨리 떨어집니다.

 

1-2. Trypsin EDTA 0.25%를 쓰는데 퍼센트로 알아보시구요

 

2. 트립신 사용 전 셀의 배양액을 제거시 꼼꼼하게 제거합니다. 

silver0  |  07.10 11:15   

그리고 media를 어떤걸 사용하시는지 모르겠지만 FBS가 들어가있다면 wash 과정에서 FBS가 덜 씻겨져서 FBS때문에 trypsin 활성이 떨어져서 그런걸 수도 있습니다.

alz  |  07.10 17:45   

저도 얼마 전에 비슷한 일이 당황했었습니다. 

Media에 FBS가 들어있지 않으신가요? 만일 그렇다고 한다면 PBS를  넣고 대략 3-5분쯤 incubator에 넣었다가 꺼내어 PBS 버리고 트립신으로 처리해 보세요. 세포들이 밀집된 틈에 끼여있던 FBS들이 트립신을 약화시켜서 그렇다고 합니다.

worstkiss@gmail.com  |  07.11 07:13   

혹시 PBS washing을 한 번만 하시나요?

 

PBS wasing 1번 2번 차이가 trypsinazation에 중요하더라고요

 

epithelial cell은 washing없어도 잘 떨어지지만 endothelial cell은 washing 1번만 하고 trypsin 처리했는데 10분이 지나도 안떨어지더라고요

제 경험이지만 washing을 충분히 해서 media에 있는 serum 성분을 제거하는 게 중요한 것 같습니다

PBS washing  |  07.12 11:48   

FBS가 배지에 들어있는 데 PBS washing을 안했거나, Cell이 계대한지 너무 오래되어 두꺼워진 상태에서 trypsin 처리했을 가능성이 있음

- 만약 후자인 경우는 monolayer를 얻기 힘드므로 새로운 세포주가 있는 경우는 버리는게 상책입니다.

 

올챙이jaebum75  |  07.12 13:16  
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