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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 Cloning 실험중 Cell culture 단계에서 실처럼 떠다니는게 뭘까요?
알실험하는꽁냥이(대학원생)  |  07.05 13:12
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20190705_132346093.jpg (79 KB)
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안녕하세요

실험을 하다 질문이 있어 여쭤봅니다.

곤충 DNA를 가지고 Cloning을 하던중 cell culture 단계에서, 

원래는 cell들이 튜브 아래에 침전되어 있어야 정상인데 침전되어있지 않고 실모양을 한 흰색 덩어리들이 떠다니네요..

제가 액체배지 만드는 과정에서 ampicillin을 잘못넣은건지 아니면 다른 시약들이 contamination된건지 궁금합니다.

알려주시면 감사하겠습니다.

#Cell culture
 
#cloning
 
#곤충
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
Bacteriophage 에 감염되어 lysis가 일어나서 그렇습니다.
일반적으로 DH5a 는 T4 phage 저항성이긴 하지만 문제가 생길 수 있고, BL21 같은 건 감수성이라 더 문제가 됩니다.
흔히 겪는 문제는 아니지만 실험실 환경에 phage 가 있다는 것이므로 동일한 문제가 발생할 수 있어 근본적으로는 향후 사용하는 competent cell 을 phage 저항성으로 바꾸는 것이 필요합니다.
다만 단순히 클로닝해서 플라스미드 DNA를 얻어 다음 단계로 넘어간다면, 배양시간을 10시간 이하로 짧게 하고 대신 배양량을 늘려 필요한 균체량을 확보하시면 됩니다.
앞다리DTer  |  07.06 07:02  

답변감사합니다.

 

어제 현상 확인 후 재 Cell Culture시, 이전에 실수로 ampicillin을

넣지않았을 때 문제 없이 실험이 된적이 있어서 ampicillin을 넣지 않고

Cell Culture을 진행하였는데 실험이 문제 없이 잘 진행되었습니다.

 

그러나, ampicillin이 문제라고 하기에는 agar 배지 상에서는 문제가 없어서

혹시 이 과정에서 phage 의심을 해볼 수 시약이나 장소가 있을까요??

 

현재, 벡터는 T-Blunt 입니다.

 

도와주셔서 감사합니다:)

알실험하는꽁냥이  |  07.06 11:08  

- 원래는 cell들이 튜브 아래에 침전되어 있어야 정상인데

: 배양 중에 shaking하지 않나요?

shaking하면 cell이 가라앉지 않을건데 rpm에 약하든지 tube 배양 각도에

문제가 있을수도 있습니다.

그리고 vector가 들어간 균은 항상 항생제를 넣고 배양해야 합니다.

사진처럼 균이 보이는 것은 항생제하고는 아무런 관계가 없고 phage하고도

관계가 없습니다.

배양 중 shaking만 정확히 하면 실같은 것이 생기지 않을 겁니다.

대왕개구리SPEED  |  07.06 13:18  
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