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ROS detection
레벨1 라꼼 (과기인)
안녕하세요.
ROS assay를 다년간 했던 연구원입니다.
이제까지는 별무리없이 데이터를 냈습니다.
1년 정도 안하다가 다시하니 잘 안되네요.
drug는 cocl2를 사용합니다. (25uM~1000uM 까지)
facs data에서 control보다 왼쪽으로 shift되기에 형광을 확인해보니 control에서도 엄청나게 발현되고 있더라구요.
1. control에서도 높은 발현되는 것은 세포상태의 문제일까요?
2. cocl2는 보통 어떤 농도 시간에서 ROS가 올라갈까요?
이제까지 약물들은 보통 15분이내에 가장 올라갔었는데, 이번엔 control값이 워낙 높으니 비교가 안되네요. 다른 논문은 보면, 400uM 24hr, 600uM 6 hr 등 조건으로 실험하셨더라구요.
3. 제가 시약까지 따로 샀는데,
sigma사의
D6883 / 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate is a cell-permeable non-fluorescent probe. 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate is de-esterified intracellularly and turns to highly fluorescent 2′,7′-dichlorofluorescein upon oxidation.
Applications include sensitive and rapid quantitation of oxygen-reactive species in response to oxidative metabolism; microplate assay for detecting oxidative products in phagocytic cells, and quantitative multiwell myeloid differentiation assay.
35848 / 2′,7′-Dichlorofluorescein
2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate may be used as a superior gas phase alternative to underivatized fluorescein and as a component/substrate of the 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate assay to quantitate reactive oxygen species (ROS).
의 차이가 뭘까요?
참고로 같은 조건으로 염색했을때 35848이 훨씬 발현을 잘하고 D6883은 거의 까맣게 보입니다.
실험방법은
confocal
cell seeding
drug treat
dcfda treat 5 uM, 15~30 min
washing (PBS or HBSS)
confocal
facs
cell seeding
drug treat
dcfda treat 5 uM, 15~30 min
washing (PBS or HBSS)
cell harvest
washing
facs
조건도 여러가지로 바꿔봐서 기억도 잘 안나네요..
조언 부탁드립니다.
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