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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR 농도가 너무 낮고 밴드가 얇습니다
올챙이sonhh1997(과기인)  | 2019.07.02 15:11
첨부파일 파일첨부: 그림1.png (20 KB)
이미지 첨부파일

Target하는 DNA는 대략 4kb정도 됩니다.

그리고 taq은 솔젠트 2X taq pcr smart kit를 사용했습니다.

근데 밴드가 상대적으로 얇고, 밝기도 연합니다. 

primer가 비특이적인 탓인가요,,? ㅜ ㅜ 

Template의 농도는 150ng/ul정도 입니다.

Template의 양을 늘리고, cycle 수도 늘려봤는데 별 차이가 없습니다ㅜㅜ

 

 

#PCR
 
#primer
 
#DNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2019.07.02   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

PCR product의 크기는 맞나요?

그렇다면 anealing temp를 여러 온도로 해 보세요.

gradient PCR을 해 보면 증폭이 잘되는 구간이 나오기도 합니다.

그래도 만족하지 못하면 PCR product를 정제해거 그걸 template로 다시 PCR을 해 보세요. 그러면 좋아질 수 있습니다.

꽃개구리느림보  |  2019.07.02   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Template가 복잡한 거라면 Taq으로 4kb 증폭이 잘 안 될 수 있습니다. 

long pcr에 적합한 효소를 사용하면 덜 피곤할 것 같네요. 예를 들면 Thermo의 Phusion, 국산 엘*스의 Pfu plus, 엔지노*스의 Pfu forte등이 생각납니다. 이 효소들은 모두 proof reading 기능이 있어서 사용하고 있는 taq 시약에 비해 이후 실험에 유리한 점이 있습니다. 

국외 회사나 국내 회사 모두 비슷한 제품군을 대부분 보유하고 있습니다. 단순한 Pfu는 4kb 증폭이 어려우니, 예를 든 제품과 비슷한 종류로 선택하는 것이 좋습니다. 

국내 제품이 더 있을 텐데 경험이 없어서 저 정도만 했습니다. 

 

올챙이sonhh1997  |  2019.07.02   

product의 크기는 맞습니다. 다른 온도로 진행해보았는데 밴드가 뜨지않았습니다. 그리고 pcr product을 정제하였지만 워낙 pcr product의 농도가 낮아서 그런지 정제하여 전기영동해보아도 밴드가 뜨지않았고 정제된 product를 template하여 PCR을 진행하였는데 전기영동에서 밝게 나타나였지만 밴드는 뜨지않고 스미어 현상으로 나타났습니다ㅜㅜ 

올챙이sonhh1997  |  2019.07.02   

 Takara LA Taq으로 진행해보았었는데, 스미어 현상이 떴었습니다ㅠ

대왕개구리SPEED  |  2019.07.02   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

일반 taq으로 4kb는 쉽게 증폭 가능합니다.

그러나 Pfu 계열로는 4kb 증폭이 가능은 하지만 수율이 낮게 나옵니다.

분명한 것은 template DNA는 현재 농도보다 1/5정도만 사용해도 PCR이

잘 증폭되기 때문에 template DNA를 늘일 필요는 없습니다.

1. annealing Tem.는 어디에서 어디까지 해봤고 시간은 얼마나 하나요?

2. primer 길이는 얼마이고 

3. template는 gDNA, plasmid, cDNA 등 어느것을 사용하나요?

4. 증폭 시간은 얼마나 하나요?

전기영동 사진을 보면 primer가 많이 남아있는거롤 봐서는 증폭 반응이

최적화 되지 않았고 저분자 위치에 비특이 band가 많이 보입니다.

꽃개구리느림보  |  2019.07.02   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

LA taq은 이런 용도가 아닙니다. 

가격도 어머나 세상에! 죠. 

올챙이sonhh1997  |  2019.07.03   

1. annealing은 65~67도 까지 해보았습니다. 65에서는 아무런 밴드도 보이지 않았고 67도에서 진행했을때 밴드는 나타났지만, 66도에서 밴드가 더 밝게 나와서 66도로 진행하였습니다 반응은 15min으로 진행합니다.

2. primer 길이는 30bp입니다.

3. Template는 gDNA 사용합니다.

4. 95도 5분 / 94도 30초, 66도 15분 (34 cycle) / 72도 10분 / 4도 ∞ 

   조건으로 진행하고 총 증폭시간은 9시간 46분 정도 됩니다. 

그러면 증폭반응을 줄이면 더 나아질까요,,?ㅠㅠ

올챙이sonhh1997  |  2019.07.03   

느림보님, 그러면 Taq을 바꾸면 좀 더 나아질까요?ㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  2019.07.03   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

현재 사용하는 taq도 문제가 없고 LA taq을 사용해도 아무런 문제가 없습니다.

PCR 조건 및 primer문제일 겁니다.

1. annealing temp.가 너무 높고 15분 또한 이해가 안되는 조건이네요.

[55도에서 45초, 58도에서 1분, 61도 1분30초]로 먼저 PCR해보세요.

2. 72도 증폭은 일반 taq으로 4~5분정도로 충분합니다.

 

올챙이sonhh1997  |  2019.07.03   

SPEED님 감사합니다. 알려주신대로 진행해보겠습니다!

대왕개구리SPEED  |  2019.07.03   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

아마도 현재 primer로 target band가 증폭이 잘되더라도 낮은 분자량에서

비특이 band가 나올 가능성은 높습니다.

증폭 조건을 2~3회 조정해서 target band가 잘 나오면 elution해서 사용하면

될것 같습니다.

그리고 cloning에 사용할 거라면 나중에 3개 정도 sequencing을 해서 base

에러가 없는 gene을 확인해 보세요.

간혹 일반 taq의 경우 4kb 정도 증폭하면 1개 또는 2개 정도 base 에러가

있는 경우도 있습니다.

물론 base에러 없이 증폭되는 경우도 있습니다.

 

올챙이sonhh1997  |  2019.07.03   

넵 감사합니다 SPEED님! 알려주신 대로 진행하고있습니다 ㅎㅎ

좋은 하루 보내시길 바랍니다!! 

꽃개구리느림보  |  2019.07.04   
결과가 궁금하네요. 알려주세요.
올챙이sonhh1997  |  2019.07.05   
첨부파일 파일첨부: [포맷변환]19.07.03 55 58.jpg (257 KB)
이미지 첨부파일

이 전기영동 사진은 첫번째는 기존 제가 하던 조건에서 Tm 55도에서 45초로 하고, extension 시간을 5m으로 하였습니다. 그리고 두번째는 Tm 58도에서 1분으로 하고, extension 시간을 5m으로 한 사진입니다. 밴드는 보이지않고 다이머만 보입니다. ㅜㅜ

올챙이sonhh1997  |  2019.07.05   
첨부파일 파일첨부: [포맷변환]190703 61 66 16s~cytb.jpg (253 KB)
이미지 첨부파일

이 사진은 첫번째는 Tm 61도, 1분 30초로 진행하고 extension을 5m진행하였습니다. 그리고 두번째는 기존의 제가 얇은 밴드를 확보했던 Tm 66도, 5분으로 진행하고, extension을 5m진행하였습니다. 밴드는 보이지않고 다이머만 보입니다.   

대왕개구리SPEED  |  2019.07.05   

template는 150ng/ul를 사용했나요?

prmier 길이가 30mer 정도 된다고 했는데 계산 사응로 Tm이 어느정도

나오나요?

그리고 제일 처음 첨부한 사진의 연한 band가 4kb위치가 맞나요?

올챙이sonhh1997  |  2019.07.05   

네 Template 150ng/ul 입니다. 그리고 Tm은 forward는 65.5이고, reverse는 60.8입니다. 그리고 연한 밴드의 크기는 marker와 비교했을 때 4kb 맞습니다! 

대왕개구리SPEED  |  2019.07.05   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

gDNA PCR의 경우 비특이 band가 나오는 경우가 많은데 band가 하나도

안나왔네요..

55도 45초까지 gDNA에 붙을 자리가 없다는 뜻입니다.

48도, 30초/ 48도 1분, 72도 7분으로 PCR해서 band가 안나오면

Taq 또는 primer 문제로 생각해야 할 것 같습니다.

혹시 일반 taq 중에 현재 회사가 아닌 다른 회사 제품을 가지고 있나요?

그리고 55도, 58도와 61도 전기영동 사진을 보면 남아있는 primer가

61도가 제일 많이 남아있는데 이 부분도 왜그런지 생각을 조금 해봐야 할것

같습니다.

3조건 동일하게 반응이 안되었으면 남아있는 primer 양이 비슷해야 합니다.

올챙이sonhh1997  |  2019.07.05   

넵 알려주신대로 한번 진행해보고 결과가 안좋다면 Taq을 교체하거나 primer를 다시 디자인해봐야겠습니다. 감사합니당 !!ㅜ ㅜ 

대왕개구리SPEED  |  2019.07.05   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

남아있는 primer는 위 답변에서 착오가 있었네요 정정합니다.

55도 = 58도 = 61도 < 기존 조건

동일한 primer양으로 증폭이 안되었는데 기존 조건의 primer가 상당히

양이 많은 것은 이해가 안가는데 피펫팅에 조심해서 하시고 냉동된

primer를 녹이고 잘 혼합해서 반응에 사용해 보세요.

올챙이sonhh1997  |  2019.07.05   

primer가 template보다 많이 들어갔습니다. 지금 쓰고 있는 Taq의 사용설명서를 보면 2ul를 넣으라고 명시되어있습니다. 그래서 Template는 농도에 따라 조절하라고 명시되어있어 1ul를 넣어서 진행했습니다. 

조성이 혹시 잘못된건가요,, Taq 사용설명서에 명시된 양으로 진행했습니다. 

조성은 taq mixture 25ul, Template 1ul, primer 2ul (F,R each), 3DW 20ul로 진행하였습니다!

꽃개구리느림보  |  2019.07.16   

PCR이 잘 안되는 이유를 다 따져보기에는 인생이 너무 짧습니다. 

사용하고 계신 프리믹스 제품은 4kb 클로닝에 적합한 제품이 아닙니다. 안되는 것은 아니겠죠. 많은 고생을 자처하지 마시고, 적합한 제품을 시험해 보시길 권해드립니다.  

그리고 PCR 관련 질문에는, 주형 DNA나 프라이머가 어떤 거며, 농도 단위는 무엇이며, 온도 프로그램은 어떤 것인지 조금 더 정확하게 알려줘야 이해가 쉬울 겁니다. 

아직 실험 진행 중이라면 다시 좀 알려 주세요. 

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