실험Q&A를 통해 여러분의 지식을 나누어 주세요. 답변을 등록하시려면 로그인 해주세요.
본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
band가 나오지 않으면 reprobe 시킨 후 blocking부터 다시 시작하면 됩니다.
band가 안나왔다면 처음부터 다시하거나 ECL 양을 늘리거나 시간을 늘려서 detection하지 1차 antibody를 처리하지는 않습니다.
antibody 낭비입니다.
염색약이 덜 빠진 상태로 진행해도 무방합니다.
protein까지 washing될까 걱정된다면 DW로 washing해보시길 추천합니다.
1. TBS-T, PBS-T로 워싱과정에서 단백질이 워싱될 일은 없다구 보시면 되구요.
2. ECL 과정까지 했는데, 안나왔다면.. 진짜 깔끔하게 하고 싶으시면 stripping buffer로 strip 하시고 하셔도 되고 아니면 위에 분 말처럼 블라킹 과정부터 하면 될 거 같네요.
3. 보통 워싱은 5-10분정도로 3회정도 하고 있습니다만 길게는 1시간까지 해본적 있었는데, 밴드 잘나옵니다 ㅎㅎ
-
레벨2
ddw604
(대학원생)
-
19.07.02 10:39
답변감사합니다..!
그런데 reprobe와 strip한다는 게 어떤 것인지 여쭤봐도될까요 ..
western blot 할때 strip buffer를 사용하지 않아서요..
기존에 붙여놓은 Ab를 제거하여 blocking 이전의 상태로 돌리는 것을 stripping 이라고 하고, stripping 후 다시 blocking, 1st, 2nd Ab를 붙이고 단백질을 확인하는 것을 reprobing 이라고 합니다.
stripping을 통해서 비슷한 크기의 단백질 또는 같은 크기를 가진 phospho-, total- 단백질을 같은 membrane 상에서 확인할 수 있습니다.
-
레벨2
ddw604
(대학원생)
-
19.07.02 13:50
정말 감사합니다!
blocking 이전상태로 돌리기 위해서는 stripping buffer로 진행을 해야하는 것인가요?
네 그렇습니다.
stripping 과정을 통해 membrane 위에 붙어있던 것들이 떨어집니다.
detection하고자 하는 단백질까지도 떨어뜨리기 때문에 stripping은 최대 2~3번까지만 진행 가능합니다.
그래서 stripping한 후 웨스턴을 진행할 때에는 antibody 처리시간이나 ECL 처리시간을 조금 길게 하는 것을 추천합니다.
자세한 것은 stripping and reprobing을 검색해보세요.