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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 라이게이션이...이상합니다....ㅠㅠ
뒷다리졸업은언제하나(대학원생)  |  06.28 16:43
첨부파일 파일첨부: 라이게이셔어어어언.JPG (22 KB)
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안녕하세요 :D

저번에 라이게이션이안된다고 문의글 올렸던 대학원생입니다.

네..라이게이션이....이상합니다...된것도 같은데 안된것도 같습니다...

 

저번에 라이게이션이 안되는 것 같다는 제 질문에 많은 감사한 분들께서 댓글로 이것저것 조언을 많이 주셨는데요..

몇가지는 진행해보고, 몇가지는 진행 중에 있습니다.

(제 전질문은 요기: http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=662338&ksr=1&FindText=T4%20DNA%20ligase%2065)

 

Genscript에서 DNA를 합성해서 pUC57에 합성해서 받았으며,

vector로 사용한 플라스미드는 pET23a+입니다.

pET23a+는 기존에 연구실에서 클로닝에 성공한 플라스미드를 enzyme cut해서 사용하고있습니다.

(기존에 성공한 플라스미드도 Nde1, Hind3를 사용하였으며, 현재도 동일한 제하효소를 사용중입니다.)

 

전체적인 실험과정은

1. DH5a (RBC-non heat shock)에 트포한 콜로니로부터 insert/vector가 될 콜로니 각각을 따서 접종

2. DNA prep

3. Enzyme cut (takara; Nde1, Hind3) - 37℃ 3 h (2가지 동시에 진행)

4. 10x loading buffer로 inactivation 후 

5. Gel extraction

6. Ligation (NEB-T4 ligase)

7. ligase inactivation (65℃ 10 min)

8. Gel 영동 확인 및 DH5a 트포 

9. O/N 배양 - 콜로니가 없음....

 

Ligation은

RT 10 min, 16℃ 10 min, 16℃ 3 h, 16℃ O/N 으로 총 4가지로 진행하였는데요...

 

insert밴드 위로 insert의 oligomer 같은 것(?)과 vector보다 조금 큰 크기의 밴드를 확인하였습니다.

 

겔 영동으로도 확인했는데, 콜로니가 뜨지 않습니다 ㅠ_ㅠ

 

실험에 사용한 DH5a 컴셀에 문제가 있지는 않을까 했는데,

기존에 클로닝에 성공한 플라스미드를 트포했을 때, pUC57에 합성한 플라스미드도 모두 트포가 되는 것을 확인하였습니다.

그럼 왜 제 것만 되지 않을까를 고민해보았는데요..ㅠ_ㅠ

 

1. Enzyme cut된 site가 완전하게 cut되지 않았을 경우

: Nde1으로 자르고 gel 영동 후 회수해서 다시 Hind3로 잘라야하는가...?

(혹은 Nde1으로 자르고 겔 익스없이 Hind3로 자르는 것..?)

 

2. Ligation시 두 enzyme cut site 중 한 쪽만 붙고 나머지 한쪽이 붙지 않았을 경우

: Ligase의 상태를 의심해야하는지..?

(T4 ligase buffer의 상태는 fresh합니다..그 특유의 구린냄새가 납니다)

 

3. Ligation시 65℃ inactivation과정을 안하는 사람도 있던데 inactivation을 안하고 바로 트포 진행..?

: 밴드를 봤을 때, inactivation과정이 중요하게 작용하는 것 같아보이지는 않는데.....

 

4. 이 것은 다른 학생이 추천해준 방식인데..

Enzyme cut후 10x loading buffer로 inactivation후,

gel 영동-겔익 과정없이 바로 라이게이션-트포를 진행하는 것입니다.

문제는 이게 self-ligation이 된 콜로니가 같이 떠서, 하나하나 콜로니 PCR로 확인해야한다는 단점이 있습니다.

 

이것저것 문제가 될만한 것들을 찾아보고 계속 실험을 하고있는데,

어느 부분의 문제가 있는지 감이 오지 않아서 결국 또 브릭에 오게되었습니다..

 

ㅠ_ㅠ도대체 왜 안될까요

메뉴얼대로 진행하면 콜로니 하나 정도는 떠줘야하는데

정말 아무것도 없이 깨----끗 합니다 

 

 

긴긴 질문글을 읽어주셔서 감사드립니다.

즐거운 주말 되세요!

 

 

#cloning
 
#ligation
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1. Enzyme cut된 site가 완전하게 cut되지 않았을 경우

: Nde1으로 자르고 gel 영동 후 회수해서 다시 Hind3로 잘라야하는가...?

(혹은 Nde1으로 자르고 겔 익스없이 Hind3로 자르는 것..?)

: NedI, HindIII는 buffer가 많이 다르기 때문에 동시에 자르면 효율이

낮아집니다.

insert의 경우는 잘린 band만 elution 해서 사용하면되지만 vector의 경우

2cut이 잘되었는지 확인하기 힘듭니다.

아마 대부분 1cut 아닐까 생각합니다.

ligation pattern을 봐도 vector는 ligation이 거의 안되고 insert는 단편 내

ligation 반응이 잘되었습니다.

한번에 한개의 효소로 자르고 EtOH down 후에 멸균수에 녹여 다른 한개의

효소로 자르고 정제 후 ligtion에 사용하세요.

경험으로 봐서 cloning의 90% 이상은 ligation에 달려있고 ligation은 vector와

insert를 잘 준비하는겁니다.

 

2. Ligation시 두 enzyme cut site 중 한 쪽만 붙고 나머지 한쪽이 붙지

않았을 경우 Ligase의 상태를 의심해야하는지..?

: insert를 보면 ligation 반응은 정상적으로 잘됩니다.

 

3. Ligation시 65℃ inactivation과정을 안하는 사람도 있던데 inactivation을

안하고 바로 트포 진행..?

: 저의 경우 ligation 후 바로 TF합니다.

별 문제 없었습니다.

 

4. 이 것은 다른 학생이 추천해준 방식인데..

Enzyme cut후 10x loading buffer로 inactivation후,

gel 영동-겔익 과정없이 바로 라이게이션-트포를 진행하는 것입니다.

문제는 이게 self-ligation이 된 콜로니가 같이 떠서, 하나하나 콜로니 PCR로

확인해야한다는 단점이 있습니다.

: insert는 정제를 해야하고 vector는 EtOH down 후 바로 ligation 가능합니다.

위 방법은 이론적으로 될 것 같지만 상당히 확율이 낮고 cloning은 정석적인

방법으로 하는 것이 가장 빠른 길입니다.

대왕개구리SPEED  |  06.28 18:36  
첨부파일 파일첨부: pET23a+-Ex.JPG (13 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요,  SPEED님:D

매번 감사드립니다.

 

 

1. vector의 경우는 pET23a+에 다른유전자를 Nde1과 Hind3로 삽입을 시켜놓은 상태입니다. 그래서 Nde1과 Hind3로 cut을 하였을시, vector로 사용할 부분과 잘려나간 부분을 겔영동으로 확인하였습니다.

다만, 저도 vector 끼리 ligation된 밴드는 왜 보이지 않는지는 조금 의문입니다 ㅠ_ㅠ

 

2, 3. Ligation 조건을 그대로 두고 65℃ inactivation 과정을 빼고 다시 진행해 보겠습니다.

 

4. 저도 다른 학생이 추천해 준 방법은 너무 효율이 낮을 것 같아보여서 아직 진행해보지 않은 방법인데요..

vector를 EtOH로 down 후 바로 ligation이라는 하신 것은 무엇을 말씀하시는지 자세히 알 수 있을까요?

 

감사합니다^^

뒷다리졸업은언제하나  |  06.28 19:14  

EtOH down은 buffer만 바꿔주는 실험 방법입니다.

DNA 시료에 1/10 vol. 3M CH3COONa or CH3COOK + 2~3 vol.의

100% EtOH를 혼합 후 -20도 30분, 13krpm, 15min(4도), 1ml 70% EtOH

washing, dry 후 멸균수로 DNA를 녹이면 간단하게 buffer를 교환 할 수

있습니다.

하지만 원하는 DNA만 있는 경우 사용할 수 있고 질문자의 경우와 같이

pET23a를 elution해서 사용할 경우는 EtOH down이나 column으로 바로

정제를 하지 못하고 vector band를 elution한후 정제해서 사용하면 됩니다.

pET23a vector가 있으면 바로 사용해 보세요.

그리고 전기영동을 약간 더 내려보세요..

pET23a는 3.666kb인데 분자량이 맞게 나오나요?

colony가 한개도 안나온것이 조금 이상한데  TF 할때 현재 사용하는

pET23a+insert vector를 같이 TF해서 colony를 한번 확인해 보세요.

대왕개구리SPEED  |  06.28 19:38  

1. 온전한 circular plasmid의 TF은 매우 잘 관찰 되므로 효율을 계산할 필요 있음--> 10의 8승 이상 필요

2. ligation 후 gel을 걸지 말고 모든 반응물을 TF (이때, 반응물과 comp cell의 비율은 1:10 이상 유지)--> 콜로니가 안뜨므로 반응물을 젤에서 소비할 필요 없음

3. inactivation 과정은 필요없음

4. 발현에 의한 일종의 표현형 일 수 있으므로 제한배지 사용--> self ligation 된것도 안뜨면 이 경우는 아닐 수도 있음--> self가 뜰 정도의 벡터양 사용과 컴셀의 효율이 되어야 함

5. comp cell을 바꿔볼것

 

 

 

지나가다  |  06.30 15:48   
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