실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
라이게이션이...이상합니다....ㅠㅠ
레벨4 졸업은언제하나 (대학원생)
안녕하세요 :D
저번에 라이게이션이안된다고 문의글 올렸던 대학원생입니다.
네..라이게이션이....이상합니다...된것도 같은데 안된것도 같습니다...
저번에 라이게이션이 안되는 것 같다는 제 질문에 많은 감사한 분들께서 댓글로 이것저것 조언을 많이 주셨는데요..
몇가지는 진행해보고, 몇가지는 진행 중에 있습니다.
(제 전질문은 요기: http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=662338&ksr=1&FindText=T4%20DNA%20ligase%2065)
Genscript에서 DNA를 합성해서 pUC57에 합성해서 받았으며,
vector로 사용한 플라스미드는 pET23a+입니다.
pET23a+는 기존에 연구실에서 클로닝에 성공한 플라스미드를 enzyme cut해서 사용하고있습니다.
(기존에 성공한 플라스미드도 Nde1, Hind3를 사용하였으며, 현재도 동일한 제하효소를 사용중입니다.)
전체적인 실험과정은
1. DH5a (RBC-non heat shock)에 트포한 콜로니로부터 insert/vector가 될 콜로니 각각을 따서 접종
2. DNA prep
3. Enzyme cut (takara; Nde1, Hind3) - 37℃ 3 h (2가지 동시에 진행)
4. 10x loading buffer로 inactivation 후
5. Gel extraction
6. Ligation (NEB-T4 ligase)
7. ligase inactivation (65℃ 10 min)
8. Gel 영동 확인 및 DH5a 트포
9. O/N 배양 - 콜로니가 없음....
Ligation은
RT 10 min, 16℃ 10 min, 16℃ 3 h, 16℃ O/N 으로 총 4가지로 진행하였는데요...
insert밴드 위로 insert의 oligomer 같은 것(?)과 vector보다 조금 큰 크기의 밴드를 확인하였습니다.
겔 영동으로도 확인했는데, 콜로니가 뜨지 않습니다 ㅠ_ㅠ
실험에 사용한 DH5a 컴셀에 문제가 있지는 않을까 했는데,
기존에 클로닝에 성공한 플라스미드를 트포했을 때, pUC57에 합성한 플라스미드도 모두 트포가 되는 것을 확인하였습니다.
그럼 왜 제 것만 되지 않을까를 고민해보았는데요..ㅠ_ㅠ
1. Enzyme cut된 site가 완전하게 cut되지 않았을 경우
: Nde1으로 자르고 gel 영동 후 회수해서 다시 Hind3로 잘라야하는가...?
(혹은 Nde1으로 자르고 겔 익스없이 Hind3로 자르는 것..?)
2. Ligation시 두 enzyme cut site 중 한 쪽만 붙고 나머지 한쪽이 붙지 않았을 경우
: Ligase의 상태를 의심해야하는지..?
(T4 ligase buffer의 상태는 fresh합니다..그 특유의 구린냄새가 납니다)
3. Ligation시 65℃ inactivation과정을 안하는 사람도 있던데 inactivation을 안하고 바로 트포 진행..?
: 밴드를 봤을 때, inactivation과정이 중요하게 작용하는 것 같아보이지는 않는데.....
4. 이 것은 다른 학생이 추천해준 방식인데..
Enzyme cut후 10x loading buffer로 inactivation후,
gel 영동-겔익 과정없이 바로 라이게이션-트포를 진행하는 것입니다.
문제는 이게 self-ligation이 된 콜로니가 같이 떠서, 하나하나 콜로니 PCR로 확인해야한다는 단점이 있습니다.
이것저것 문제가 될만한 것들을 찾아보고 계속 실험을 하고있는데,
어느 부분의 문제가 있는지 감이 오지 않아서 결국 또 브릭에 오게되었습니다..
ㅠ_ㅠ도대체 왜 안될까요
메뉴얼대로 진행하면 콜로니 하나 정도는 떠줘야하는데
정말 아무것도 없이 깨----끗 합니다
긴긴 질문글을 읽어주셔서 감사드립니다.
즐거운 주말 되세요!
Bio마켓 프리미엄