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EDTA-free protease inhibitor를 protein purification을 할 때 주로 사용합니다. 일반적인 western sample을 준비할 때는 EDTA가 포함된 protease inhibitor를 사용해도 아무런 문제가 없고 대부분의 protease inhibitor는 효소 활성을 막아주기 위해서 EDTA를 포함하고 있습니다.
따라서 Western blotting 용 sample을 준비한다면 아무런 문제가 없습니다.
Cell lysis buffer에 protease inhibitor를 첨가하는 이유는 분리하고자 하는 단백질을 protease에 의한 분해로부터 보호하기 위해서인데, 모든 protease를 저해할 수 있는 inhibitor를 포함시키면 좋겠지만, lysate를 사용하는 목적에 따라 어떤 inhibitor는 포함시키면 안 된다.
예를 들어, Lysate에서 관심있는 단백질이 protease이고 사용 목적이 효소 활성 측정이라면, 그 protease를 저해하는 inhibitor는 포함시키면 안 된다.
EDTA는 금속이온을 포집하는 metal chealator이다. 따라서, metalloprotease와 같이 분자에 금속이온을 포함하고 있고, 금속이온이 활성에 필수적인 경우에는 lysis buffer에 EDTA를 포함시키면 안 된다. 또 관심있는 단백질에 His tag를 붙여 Ni(Cu)-charged NTA column으로 정제하고자 할 때에도 lysis buffer에 EDTA를 포함시켜서는 안 된다.
Tyrosinase는 분자구조에 Cu를 포함하는 metallo-enzyme으로, lysate로 활성을 측정하거나, His tag을 붙여 NTA column으로 정제하고자 한다면 EDTA를 포함시키면 안 된다.
하지만, Western blot은 Tyrosinase의 활성과 관계없이 단백질의 특정 서열을 항체로 검출하는 방법이므로 lysis buffer에 EDTA를 포함시켜도 상관 없다.
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레벨2
happylove951
(대학생)
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19.07.03 10:20
와... 설명에 감탄했어요. 두 분 모두 감사드립니다!