transformation할 때 heat shock이랑 electroporation 다 해보셨나요?
주로 cloning에서 gel로 band확인하는 것까지는 가능한데..
ligation 후 부터는 colony가 안뜨면.. 할 수 있는게 거의 없더라구요
만약 계속 해도 안된다면 primer design부터 다시하심이..
PCR product의 말단에 효소자리가 들어 있으면 제한효소로 잘라도 잘렸는지 확인이 안되며, 특히 일부 제한효소는 DNA 말단의 자리를 자르는 효율이 떨어집니다.
PCR product는 Taq DNA po로 증폭했을때 말단에 A가 붙어 있어서 TA클로닝하는 것이 상대적으로 쉽고, TA 클로닝 후 sequencing으로 확인하고 나서 제한효소로 자르면 클로닝하려는 insert가 양 말단이 제한효소로 잘린채 얻어지므로 목적 벡터에 클로닝하기가 용이해집니다.
TA cloning vector에 넣었다가 target vector에 넣는 것이 실험자의 방식에
따라서는 불편할 수도 있습니다.
그리고 PCR product 제한효소 처리, gel elution, ligation, TF에 대한 기술에
문제가 없으면 TA vector cloning이나 direct vector cloning이나 효율은 거의
차이가 나지 않습니다.
PCR primer 양쪽 제한효소 자리 바깥으로 몇개의 염기를 추가했나요?
경험으로 봐서는 보통 알려진것 보다는 항상 2개 정도 더 길게 넣어서 cloning
을 하는데 이렇게 하면 잘 잘리고 TA vector 사용없이 ditect로 vector에
cloning하기 쉽습니다.
TA vector를 사용하더라도
1. primer의 제한효소 cutting 효율 확인.
2. ligation mixture의 ligation 효율 확인.
위 두가지는 항상 확인 후에 cloning 실험을 진행하는 것이 좋지 않을까
합니다.
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레벨1
라땡
(과기인)
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19.06.19 21:55
다들 답변감사합니다 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
끝에 4-6개 정도 첨가하고, 이번 프라이머는 6개 첨가했습니다.(저희 실험방에서는 이렇게 알려주시더라구요/ 첨가해준 bp가 제한효소처리에 영향을 미쳤을까요?
1. backbone vector의 경우, 제한효소 처리만 하는데 조금의 끌림현상이 있기는 하지만 깔끔하게 잘려 나왔습니다! gel 내려서 크기도 확인했구요. 그래서 제한효소에 문제는 없어보였습니다!
2. ligation의 효과는 어떻게 확인해봐야할까요? ㅠㅠ 이건 어떻게 확인해봐야할지 모르겠어서요 ㅠㅠ
컴셀도 backbone을 안자르고 집어넣었을때는 잘 떠서 컴셀문제도 아닌걸로 저는 판단했습니다...
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지나가다
(비회원)
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19.06.22 12:07
프라이머 말단의 길이에 따라 제한효소 효율이 다름
--> TA 클로닝하면 이 문제가 해결됨
-->TA vector는 high copy number라서 insert 양을 많이 확보 할 수 있음
--> gel extraction 한 backbone의 농도가 너무 희석되어 TF이 않되거나 컴셀의 효율이 매우 낮음