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질문 Hydroxyproline assay 관련 질문 드립니다.
알평창군꽃등심(과기인)  |  2019.06.18 17:18

안녕하세요. 저희 연구실에서 Collagen 함량(순도) 테스트를 하기 위해 Hydroxyproline assay를 하고 있습니다.

sample은 Fish skin에서 collagen을 추출하여 TFF 필터 후 동결 건조한 collagen 을 사용하였고, Hydroxyproline assay결과 100mg collagen 에서 2mg의Hydroxyprolin(2%) 함유 되어 있다는 결과가 나왔습니다.

실험 방법은 100mg collagen을 6N HCl에 녹인 후 autoclave하여 sample로 사용 하였고 Oxidant Sol. , Ehrlich's Sol. 각각 500ul씩 사용 하여 흡광도 체크 하였습니다. Standard도 매 실험마다 다시 잡고 하고 있구요. 

다른 논문 및 자료들을 봤을때 collagen (type 1)에는 10~13%의 hydroxyproline이 함유 되어 있다고 하는데 실험 결과 수치(2%)가 너무 낮아서 문의 드립니다...

#Hydroxyproline
 
#Collagen
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.06.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 100mg collagen을 6N HCl에 녹인 후 autoclave하여 sample로 사용 하였고

: 위의 방법에서 hydroysis 시간은 어느정도 하고, 충분히 hydrolysis가 되는

조건인지 method validation이 되어있는 방법입니까?

아마도 collagen hydrolysis가 많이 되지 않았을 겁니다.

 

알평창군꽃등심  |  2019.06.18   

protocol 상 120℃ 3시간 heating하여라 라고 적혀 있어서 autoclave의 time설정을 3시간으로 변경하여 사용하였습니다. Standard 발색 및 흡광도 커브가 잘나왔고 수치가 낮다는 것은 hydrolysis가 덜 되었다고 봐야 되는 건가요?

대왕개구리SPEED  |  2019.06.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 현재 제조한 콜라겐 함량 자체가 낮을 경우 Hyp 함량이 낮게 나올수 있지만

이 가능성은 낮을 것 같습니다.

2. acid hydrolysis 조건은 110도 24시간에서 145도 4시간 사이입니다.

120도, 3시간은 아마도 많이 부족할 겁니다.

STD가 잘 나온다는 것은 assay에는 문제가 없으니까 아마도 시료 내

free-Hyp 함량이 낮아서 그런것 같으며 acid hydrolysis 조건 문제가 아닌가

합니다.

acid hydrolysis 조건에 대한 validation을 해봐서 99% 이상 hydrolysis가 일어

나는지 확인 후 실험에 적용해야 할 겁니다.

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