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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot시 pAkt band가 나오지 않아 protocol 확인 부탁드립니다!
알Ere00(대학원생)  |  06.18 17:03

안녕하세요! 고수님들 제가 western blot 진행을 하는데 total akt는 band가 나왔는데 pAkt는 band가 나오질 않아서 제가 실험하는 과정중에 문제가 있는지 확인 부탁드립니다!

-80℃에서 4~5년 보관된 mouse liver tissue를 35~45㎎ 사용하였고요

intron사의 pro-prep 5ml에 roche사의 phos-stop 1table을 녹여서 5ml tube에 600㎕을 넣고 ice에 끼운상태로 homogenizer를 사용하였고요 

ice에서 20min간 cell lysis를 유도하고 centrifuge 13,000RPM으로 15min 돌린 뒤 상층액만 새로운 tube에 넣고 -80℃에서 보관하였습니다.

gel은 10% separting, 4% stacking으로 단백질 농도는 50㎍으로 loading했습니다

transfer는 PVDF membrane을 100% methanol에 적시고 transfer buffer에 한번 담그고 공기방울 최대한 없앤 뒤 100V에서 2hr 30min을 하였고요

transfer후에 100% methanol에 다시 한번 적시고 blocking하였습니다

blocking은 TBS에 5% skim milk을 사용하여 R/T에서 1hr 반응한 뒤 바로 1차 antibody를 붙였습니다.

1차 antibody는 cell signaling사 pAkt를 사용하였고 1:1000으로 TBS(pH7.6)에 5% skim milk를 o/n, 4℃에서 반응하였습니다.

TBS-T로 15min간 3회 washing을 하고 santa cruz사의 2차 antibody를 1:2000으로 TBS에 5% skim milk을 사용하였습니다.

또 TBS-T로 10min간 3회 washing하고 TBS-T가 있는 상태로 암실에서

Health care사의 ECL kit을 1:1 비율로 mix후 1min간 반응하고 cassette에 뿌린뒤 1min간 반응후 X-rat film으로 감광하였습니다.

#western blot
 
#pAKT
 
#실험
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

 

혹시 찍는 시간이 너무 짧았던 것은 아닐까요? 

원래 cell signaling꺼로 total이랑 phospho akt 두개 같이 찍으면

total은 짧은 시간에 진하게 나오는데

phospho는 오랜시간을 찍어야 나옵니다.

찍는 시간을 1-100초씩 한 30장으로 설정해서 찍어보세요.

그래도 나오지 않는다면 트랜스퍼에 문제가 있었을 수 있으니

폰슈로 염색해서 다시 확인해보세요.

ㅇㅇ  |  06.18 20:15   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

전 실험상에는 큰 이상이 없어 보입니다. 물론 안나오니 발색시간을 더 두는것도 방법이긴 하겠죠... 그런데... nothing을 시간을 더 둔다고 시그널이 올라올것 같지는 않네요...

어쨋든 체크는 해봐야하니 기존 1분에서 10분까지 늘려보세요... 만약 시그널이 나온다면 다시 substrate 처리후 시간을 줄이시면 됩니다.

그러나 실험방법이 문제가 없다면 항체나 항원을 고민해봐야 합니다. 물론 항체는 돈주고 사는거니 이상없다 가정하고 항원을 고민해보면 셀라인을 가지고 PC sample을 만드세요... 그 샘플을 같이 걸어서 내 샘플이 문제인지를 확인한다면 항원문제를 체크할수 있습니다.

금개구리안재진  |  06.19 10:13  

phospho form 단백질 잡을 때는 보통 skim milk를 쓰지 않습니다.. BSA를 쓰게 되고, blocking을 PVDF 멤브레인의 경우 methanol에 담궜다가 자연건조 시키는 과정으로 대체하게 되지요.. skim milk에 있는 카제인 단백질이 phospho-epitope가 비슷해서 종종 문제가 생깁니다..

올챙이더잘하고싶다  |  06.23 01:23  
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