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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western 할 때 BSA로 blocking
올챙이ddw604(대학원생)  |  06.15 13:40

안녕하세요

인산기 band 보려고 1차 2차 항체를 BSA에 희석하여 붙이고 있습니다.

blocking buffer랑 항체 희석에 사용한 거랑 같은게 좋다고 들은적이 있어서

BSA로 blocking 진행하는데요 .

blocking이 전혀 안되는지 detection하면 멤브레인 모양으로 까맣게 타버려요..

5%BSA로 blocking 하고있습니다. 시간은 30-40분 정도로 하고있어요.

blocking 시간을 늘리면 괜찮아질까요..ㅠ?

그리고 skim milk로 blocking 하고 BSA에 딜루션한 항체 사용해도 괜찮나요?

 

조언 부탁드립니다..감사합니다

 

#BSA
 
#blocking
 
#western blot
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

blocking 시간이 너무 짧습니다.

저는 상온에서는 최소 2시간 또는 냉장고에서 o/n합니다.

그리고 skim milk와 bsa 교차 사용해도 잘 나옵니다.

phospho- form의 경우 milk로 blocking 하는 것이 안좋다곤 하는데,

저는 milk로 blocking 하고 bsa로 항체 사용해도 데이터 내는 것에 지장 없었습니다.

올챙이당구왕빠킹  |  06.15 19:13  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

블라킹 1시간 정도 하시면 되구여

교차 사용은 상관 없습니다.

개구리애니  |  06.15 22:24  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

저는 날이 무더운날에는 실온 1시간, 날이 추운날엔 실온 2시간 skim milk로 blocking 합니다. 에어컨이나 난방기로 온도가 비슷하게 유지된다고는 하지만 저는 늘 이렇게 실험하구요..

Phospho는 BSA, 나머지는 Skim milk로 사용해서 blocking을 합니다.

Phospho detection일 경우 Skim milk로 사용시 basal level이 올라가고 casein이 phospho specific detection을 방해한다고 들어서요. 비교실험은 해보지 않았습니다.

 

 

도움이되시길  |  06.17 09:15   

BSA가 원래 블락킹 효율이 매우 낮습니다. Milk가 효과가 좋지요.

밀크로 블락킹하고 BSA에 희석한 항체를 사용하세요. 블락킹과 항체 희석에 다른걸 사용해도 전혀 문제 없습니다.

꽃개구리visavis  |  06.19 00:06  
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