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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 코돈의 세번째 염기가 바뀌는 이유
꽃개구리TX(과기인)  |  06.15 07:35

Cloning 한후에 DNA sequencing 결과를 보면 가끔 코돈의 3번째 염기가 바뀌는 현상이 보입니다. 물론 아주 드물지만..

이런 이유가 궁금하네요

먼저 PCR 과정에서 error에 의한 것인가요?  만약 이런 경우라면  2번째, 또는 1번째도 랜덤하게 나와야 할텐데, 꼭 3번째 염기가 바뀌네요.  또한 이렇게 바뀐 3번째 염기도 codon redundency 의해 아미노산은 그대로 입니다. 예를 들어 GGC의 C가 T로 바뀌고, 아미노산은 Gly 그대로 이런 식입니다.

그렇다면 plasmid가 E.coil 에 transformation된 이후, 세포 내에서 3번째 염기의 mutation 이 일어난다고 볼수 있겠는데...이게 핵 내에서 plasmid의 replication 과정중 일어나는 걸까요?  아니면 plasmid가 세포 내에서 머무는 도중에 일어나는 걸까요?  만약 그렇다면 이것과 관련된 단백질은 뭘까요 ??

만약 그것도 아니라면, plasmid를 mini-prep 하는 과정 도중이나 냉장 보관 도중에 바뀌는 걸까요?

#염기 돌연변이
 
#코돈
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

저희 실험실에서도 여러가지 origin의 gene들을 몇 년째 취급하고있는데 plasmid T/F한 후에 E.coli 내에서 codon이 변하는 경우는 아직 확인하지 못하였습니다.

따라서 제 생각엔 단순히 PCR시에 우연의 일치로 codon의 3번째 base만 error가 난것으로 보입니다.

계속 error가 난다면 error rate가 낮은 pfu 계열의 polymerase를 사용해서 해보세요~

pfu 계열 polymerase를 사용할 때는 3' A overhang이 없기에 추가로 붙여주어야하고 그런 작용을 하는 enzyme은 보통 enzyme을 취급하는 대부분의 회사에서 취급하며 따로 판매합니다.

이드  |  06.15 09:49   

DNA 서열의 변화는 PCR에서 대부분 일어날 겁니다.

codon이 E. coli와 맞지 않으면 DNA를 변경시키지는 못하지만

아미노산 및 단백질 합성 효율이 낮아집니다.

- 핵 내에서 plasmid의 replication 과정중 일어나는 걸까요? 

E. coli는 핵이 없기 때문에 cytoplasm에서 replication이 일어나구요..

- plasmid가 세포 내에서 머무는 도중에 일어나는 걸까요?

: 세포 내에서 DNA 교정이 일어나는 경우는 돌연변이 및 복제 중 base

error가 일어나지 않으면 거의 일어나지 않습니다.

- plasmid를 mini-prep 하는 과정 도중이나 냉장 보관 도중에 바뀌는 걸까요?

: 보관 중에 분해는 되어도 바뀌는 경우는 없습니다.

아마 PCR 에러라고 생각듭니다.

 

 

 

 

대왕개구리SPEED  |  06.15 12:58  

PCR 클로닝해서 염기서열 분석해 보면 종종 mutation이 발견됩니다.

어떤 사람은 많은 클론들 중에 mutation이 없는 클론을 찾겠다고 여러 colony를 배양해서 염기서열을 보지만 대부분의 경우, mutation이 없는 클론을 찾지는 못합니다.

왜 그럴까요?

DNA 두 가닥 중 DNA 복제 오류로 mutation이 발생하다면 DNA 두 가닥 중 한가닥일 것이고, 그러면 PCR의 첫 cycle에서 error가 났다면 두 colony 중 하나는 mutation이 없어야 정상입니다.

만일 PCR 중간에 어느 한 DNA 분자에서 mutation이 생긴다면 수천개 클론 중 단 하나 정도만 mutation이 들어가야 합니다. 즉, 거의 모든 클론은 정상적인 염기서열을 가져야 맞다는 겁니다.

 

그런데도 왜 TF 후에 얻은 모든 클론이 mutation을 가지는 걸까요?

이럴때는 원 template가 mutation을 가지고 있다고 봐야 합니다.

 

보고된 유전자 염기서열이 PCR 클론관 다르다면, Pfu DNA pol을 mutation을 피할 수 없다면 template가 그런 염기서열을 가지고 있는 겁니다.

 

mutation은 염기선호가 없으며( 또는 적으며) 특히 코돈의 wobble 염기가 바뀌어도 아미노산은 그대로인 silence mutation이라면 실험에 별 영향이 없으므로 그냥 실험을 진행하셔야지요.

대왕개구리강시  |  06.16 08:22  

- 대부분의 경우, mutation이 없는 클론을 찾지는 못합니다.

: 강시님 본인 경험 얘기인지요?

수많은 gene을 PCR cloning 해왔지만 mutation 없는 gene은 항상 얻을수

있었는데 어떤 근거로 mutation이 없는 클론을 찾지는 못한다고 하나요?

대왕개구리SPEED  |  06.16 13:21  
대부분의 클로닝은 돌연변이가 없는 온전한 클론이 나옵니다.
하지만 어쩌다가 돌연변이가 나오는 경우, 다른 콜로니를 키워서 분석해보면 온전한 클론이 나오지 않았습니다. 제 경험입니다.
대왕개구리강시  |  06.16 17:24  

PCR 클로닝해서 염기서열 분석해 보면 종종 mutation이 발견됩니다.

어떤 사람은 많은 클론들 중에 mutation이 없는 클론을 찾겠다고 여러 colony를 배양해서 염기서열을 보지만 대부분의 경우, mutation이 없는 클론을 찾지는 못합니다.

 

여기서 

 

대부분의 경우, mutation이 없는 클론을 찾지는 못합니다..... 이 부분만 쏙 따오면 클로닝을 할 때마다 항상 mutation이 나온다 라고 오해합니다.

 

클로닝을 하면 mutation이 발견되는 경우가 있는데 그 경우에, 다른 콜로니를 분석해 봐야 대부분 같은 mutation이더라.... 라는 의미입니다. 그래서 template를 의심하라는 거지요.

제 글을 잘 읽어 보시지요. 

대왕개구리강시  |  06.16 17:44  

저도 크게 두 가지 경우가 있다고 생각이 드는데요...

1. pfu 기능이 낮은 taq을 쓰면 mutation 이 많이 생길 수 있습니다.

하지만 이 또한 확률적인 문제이며, pfu 기능이 있더라도 낮은 확률로

mutation이 생길 수 있습니다. 하지만 이게 꼭 CDS region의 세 번째 codon일

가능성은 없습니다.

2. 원래 template로 사용한 vector나 DNA 염기 서열 상에서 이미 variation을

가지고 있는 경우입니다. 우리 몸에는 수 많은 synonymous variation을 가지고 

있습니다. 물론 다른 생물들도 마찬가지이구요, 이런 DNA를 template로

사용했기 때문에 '하필' 3번째 codon이 다른 걸로 바뀌어 있는 걸 보셨겠지요

제 생각입니다만, 3번째 codon이 바뀌어 있더라도 대부분 silent mutation일

가능성이 높다고 생각합니다. (또는 non-pathogenic effect를 주는 가벼운

아미노산으로의 치환 정도라 생각이 되네요.)

지나가다  |  06.16 19:51   

모든 답변 감사드립니다.

답변에서 결론은 PCR error로 보인다...인듯 하네요...

일단 저와 같이 클로닝 도중에 코돈의 3번째 염기가 바뀌는 현상을 경험하신 분들이 없는듯 하네요.. 저도 상당히? 많은 cloning 경험이 있는데, 분명 이런 현상이 있는건 확실것 같은데 말이죠..

특이한점은 3번째 코돈중 C가 T로 바뀌더라구요. (가끔은 A로도 바뀌지만) . 혹시나 이게 대장균(DH5a 입니다)의 코돈 편향에 따라  codon ratio가 낮은 codon의 tRNA는 대장균이 스스로 없애 버려? (가령 전사를 방해하는 어떤게 생긴다거나...그럼 이유는? 이게 혹시나 제가 DH5a를 아주 오랫동안 계속 키워 쓰면서 컴셀 만드는데, 그래서 대장균도 노화?가 생겨 그런건지..하여튼) 그래서 DNA replication 도중 C를 T로 바뀌 버리는 현상이 혹시라도 일어나지는 않을까? 해서 질문드려봤습니다. 

그리고 제가 무식하게 대장균에서 "핵내"라는 표현을 썼네요...

꽃개구리TX  |  06.20 05:22  
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