실험 Q&A Cell Biology > Differentiation/Proliferation
cell proliferation 실험중입니다. BrdU labeling 시기가 궁금합니다.
레벨1 ephedra (과기인)
안녕하세요 올해 석사 시작한 연구 초보자입니다.
현재 약리학 관련 분야 연구를 하고 있고, 약물 처리시 cell proliferation과 apoptosis를 관찰하고 있습니다.
MTT로 약물 농도별 cell viability는 확인하여 viability가 많이 떨어지지 않는 농도를 잡아 BrdU로 proliferation을 확인하는 실험을 하고 있습니다.
제가 연구실 첫 학생이라 이것저것 자세한 것을 여쭤볼 선배가 없는 상황이라 사소한 질문이지만 브릭 선배님들께 도움을 받고자 질문글을 작성하게 됐습니다.
저는 현재 Roche사의 BrdU cell proliferation assay (ELISA) kit을 사용하고 있습니다.
BrdU 실험을 진행하던중 BrdU labeling 시점에 대한 의문이 생겼습니다.
제품 프로토콜을 보면 각 실험 조건에 따른 일정시간의 약물처리 이후 2-24시간동안 BrdU labeling을 하고 이후 과정을 진행하는 것으로 나와 있습니다. 많은 논문에서 제품 프로토콜대로 실험을 진행 한 것도 확인했습니다.
그런데 여기서 의문점이 있습니다. 약물을 처리한 뒤 일정시간이 지나면 각 조건마다 cell 농도의 차이가 나게 될 것입니다. 그 상황에서 BrdU labeling을 하면, 정확히 cell proliferation을 측정하는 것이 아니라고 생각됩니다. cell 농도가 같은 조건에서 BrdU incorporation이 일어나야 정확히 cell proliferation 속도를 비교할 수 있다고 생각됩니다. 혹시나 약물이 apoptosis도 일으킨다면 더더욱 cell proliferation을 제대로 측정하는 것이 아니라고 생각됩니다.
그래서 논문을 더 찾아보니 seeding 이후 일정시간 starvation media를 처리하여 cell cycle을 synchronize시킨 뒤, 약물처리를 하는 동시에 BrdU labeling을 시키는 경우도 있는 것으로 확인했습니다. 그런데 이 경우에도 문제점이 있다는 자료를 찾았습니다. starvation 이후에 10% FBS media를 처리하면 cell proliferation 속도가 급격히 증가할 수 있다는 것입니다. 그래서 약물의 효과를 sensitive하게 잡아낼 수 없는 것 같습니다. 또한 제가 처리한 약물이 처리 즉시 proliferation에 영향을 주는 것이 아니고, 일정시간 뒤에 cell에게 영향을 주는 약물이라면 위 방법으로 약물의 효과를 제대로 보여줄 수 없다고도 생각됩니다.
이미 위에 말씀드린 두가지 방식 모두 실험을 진행했고, 결과를 얻었습니다.
첫번째 방식대로 했을 경우 결과가 매우 좋게 나오지만, 위에 말씀드린 이유 때문에 MTT와 큰 차이가 없는 실험이 되어 proliferation을 정확히 보여주는 데이터가 아닐 것 같습니다. (MTT보다 더 큰 차이가 나타나긴 합니다)
두번째 방식대로 했을 경우 결과값이 만족스럽지는 못 하지만 변화가 측정되긴 합니다. 그러나 이 경우 실제 cell에게 영향을 준 것보다 효과가 미미하게 나오는 것 같아 약물의 효과를 더 잘 보여주는 세팅을 찾고 싶습니다.
BrdU kit이 가격이 상당하기 때문에 제가 하고싶은대로 이것저것 해보며 세팅하기 부담됩니다 ㅠㅠ 선배님들께서는 BrdU를 어떤식으로 진행하시는지 궁금합니다.
제가 현재 생각중인 방법은 첫번째 방식대로 약물 처리 이후 labeling하여 얻은 결과를 같은 조건의 약물을 처리한 MTT 결과나 cell counting 결과로 나눠주는 것입니다. 그런데 이 방식을 사용한 선행논문이 없어 선뜻 진행하기 꺼려집니다. 선배님의 의견 듣고싶습니다. 감사합니다.
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