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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 plasmid에서는 되는 PCR이 genomic DNA에서는 안돼요 ㅠ
올챙이나람(대학원생)  |  05.31 09:57
human gene을 normal PCR 해서 증폭시키려고 하는데 plasmid에서는 밴드가 진하게 뜨는 걸 확인했거든요?
근데 genomic DNA 에서 똑같은 조건으로 실험했는데 안 뜨네요 ㅠㅠ
마커보다 위쪽에 희미하고 스미어한 밴드가 보이는데 이건 gDNA 같구요. 희미해서 그런데 dna 농도가 작은 걸까요? 50ul 당 template 500ng으로 했거든요 plasmid PCR도 마찬가지로요....

똑같은 프라이머로 돌려서 annealing 온도도 똑같이 설정했고 plasmid는 나와서 당연히 똑같이 했는데 왜 gDNA에서는 안나오는걸까여 ㅠ human gene이라서 gDNA에는 분명히 있을텐데....
#genomic DNA
 
#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

gDNA의 경우 exon + intron 구조로 되어 있어 전체 크기가 얼마인지 보고

증폭 시간을 설정해야 하며 일반적으로 cDNA에서 증폭합니다.

gDNA에서 증폭이 되더라도 exon + intron 구조면 사용이 힘들겁니다.

template 양도 1/20 이하로 줄여서 PCR하는 것이 좋습니다. 

대왕개구리SPEED  |  05.31 10:16  
윗분 말대로 pcr primer 가 인트론을 끼고 있는지 확인은...(당연히) 하셨겠죠? 왠지 안했을 것 같은 예감이 ㅎㅎ, 플라스미드와 gdna양을 동일하게 사용했다면 플라스미드에 template이 최소 수만배는 더 많이 들어있는 상황이에요. 종이 펴 놓고 생각해보세요. 지놈의 길이와 플라스미드 벡터 길이 비교~.
개구리병리초보  |  05.31 13:07  

Eukaryotic genomic DNA와 cDNA의 구조적 차이

Eukaryote의 genomic DNA는 단백질을 coding하는 Exon과 단백질을 coding하지 않는 Intron의 불연속적인 구조로 이루어져 있다. cDNA는 전사과정에 splicing에 의해 intron 부분이 제거된 mRNA를 주형으로 합성한 상보적인 DNA이므로, Exon들만 연결된 구조로 이루어져 있다.

PCR primer의 위치에 따른 PCR 여부

Primer의 위치가 Exon 부분에만 위치한 경우는 genomic DNA나 cDNA에 상관없이 PCR 증폭이 가능하다. 다만 genomic DNA는 intron을 포함하고 있어 intron 크기만큼 PCR product의 크기는 증가한다. 크기가 크진 만큼 cDNA를 주형으로 사용하는 것과 동일한 PCR 조건에서는 증폭되지 않을 수 있다. PCR primer의 위치가 1개 이상의 Exon에 걸쳐 있는 경우, Exon만으로 연결된cDNA를 주형으로 사용할 경우에는 PCR 증폭에 문제가 없으나, genomic DNA를 주형으로 사용하는 경우에는 불연속적인 Exon으로 인해 PCR이 되지 않는다.

 

upload_image

 

개구리DTer  |  06.04 16:54  

다들 답변 감사한데 cDNA로 해도 안나와서요 ㅠㅠㅠ 프라이머 어닐링 온도 다르게 설정해도 다 안나오는데..... DNA 농도를 높여야 되는 걸까요..?

올챙이나람  |  06.10 09:35  

Plasmid에 클로닝된 유전자를 template로 했을 때

PCR이 된다면 PCR primer나 조건의 문제는 아닙니다.

 

Plasdmid와 cDNA에서 실험조건의 차이는 template이므로

Template인 cDNA에 문제가 있을 가능성이 큽니다.

 

1) cDNA를 만든 세포에서 해당 유전자를 발현하지 않거나

2) 발현은 하는데, cDNA를 만드는 과정에 문제가 있을 경우

개구리DTer  |  06.14 10:37  
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