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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Wetern blot의 반응이 너무 약합니다...
알WVAVW(대학원생)  |  05.20 11:13
첨부파일 파일첨부: ws.png (53 KB)
이미지 첨부파일

 

위는 Western blot의 결과
아래는 해당 sample의 SDS PAGE결과입니다.

그나마 위의사진이 잘 나온것이고
이 샘플 외에도 Western blot의 밴드가 너무 약하게 나옵니다.

페놀방식을 이용하여 식물 단백질을 추출하였고
추출한 단백질을 SDS page 진행후 Western blot을 진행하였습니다.
2차항체는 Ap congugation된것을 사용하였고
트랜스퍼도 마커가 진하게 옮겨진것으로 보아 이상이 없을거라 생각됩니다.
SDS PAGE상의 농도가 높던 낮던 Western blot의 결과는
항상 희미하게 나타납니다.

혹시 이러한 현상에 대한 답을 알고계시다면 알려주시면 감사하겠습니다.
 

# Western blot
 
#band
 
#Ap congugation
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안녕하세요!
잘은모르겠지만.. 프로테인 양은 충분 하신가요..??
프로테인양부터 충분히 하시고 다시해보셔도 될 것 같습니다!!!
힘내세요!
올챙이후앗  |  05.20 13:11  

Ap는 제가 잘 모르는 것이라 해당 내용은 패스할게요. (HRP 붙은 것만 써봐서)

밴드의 강도를 강하게 만드는 방법들...

1. 단백질의 양을 크게 증가시켜 본다.

2. 1, 2차 안티바디의 양을 증가시켜 본다.

3. 매우 강한 발색시약을 구입하여 사용한다. (HRP의 경우 ECL이라고 하며, GE헬스케어에서 나오던 셀렉트였나? 그것이 상당히 셌던 것으로 기억합니다.)

4. 사진을 찍는 기계에 따라 다르겠지만 감도를 크게 올려서 찍는다.

5. 타겟이 아닌 밴드가 강하게 찍히는 경우 해당 밴드의 사이즈를 잘라서 찍는다. 밴드가 약한 것은 상대적일 수도 있습니다.

6. 찍은 후 음영 level 을 조절한다. (기계 프로그램에 있으면 그것을 사용하고, 없으면 포토샵 레벨 조정기능)

 

 

개구리절대교주  |  05.20 14:58  

AP 발색을 하셨으면 반응시간을 올려보세요. 아니면 NBT/BCIP 농도를 올려보는것도 방법입니다.

이것보다 더 쎈 반응을 원하시면 HRP 항체로 필름이나 장비로 확인하시면 저 정도 밴드면 충분히 나올것입니다.

금개구리안재진  |  05.21 13:22  
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